[发明专利]一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法。

背景技术

地中海贫血（Mediterranean Anemia)，也称海洋性贫血(Thalassemia)、库勒(Cooley)贫血、珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫，分别由α-蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇异常表达引起。该病高发于地中海沿岸、非洲、拉丁美洲、东南亚、东亚、南亚，等热带、亚热带广大地区。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地贫的发病率是15.5%，广东α-地贫的患病率为8.53%。中国人群中，α-地贫的基因型常见的为缺失型--^SEA、-α^3.7、-α^4.2和--^THAI，以及突变型有Constant Spring(Hb CS，基因型为α^CSα)、Hb Westmead(Hb WS，基因型为α^WSα）和Hb Quong Sze(Hb QS，基因型为α^QSα)；中国人群中常见的β-地贫缺失型主要为HPFH-SEA和DBT。

目前检测缺失型地中海贫血的主要方法有Gap-PCR、高分辨溶解曲线（HRM，High-Resolution Melting）、MLPA(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Assay)、Southern blot分析法等。检测非缺失型地中海贫血的主要方法有PCR-RDB（Reverse Dot Blot)法、变性高效液相色谱(DHPLC，Denaturing High-Performance Liquid Chromatography)法、等位基因特异PCR法(Allele-specific PCR，AS-PCR)法、HRM法和测序法等。以上方法单独应用在地中海贫血基因型检测中各有优缺点。

基于荧光标记定量PCR技术是一种广泛用于法医学检测的技术，其优势在于检测精度高，通量大，且操作快速、简单。目前还未见有将AS-PCR法和Gap-PCR法与荧光标记定量PCR技术结合，以实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的--^SEA型(东南亚型)，-α^3.7，-α^4.2，--^THAI(泰国型)，α^CSα，α^QSα和α^WSα，以及β地中海贫血的HPFH-SEA(异常血红蛋白合并遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症)，东南亚缺失型(HPFH-SEA)和DBT(中国型)地中海贫血基因型检测的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法。采用该方法可实现单管对α地中海贫血的--^SEA型，-α^3.7，-α^4.2，--^THAI，α^CSα，α^QSα和α^WSα，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，包括以下步骤：

(一)引物设计

(1)设计一条通用引物，该引物与人类基因组没有同源性，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物；

(2)针对检测位点，设计一系列基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对或可用于基因片段定量的扩增引物对，包括正向引物和反向引物；

(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；

(二)PCR检测