[发明专利]一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法

权利要求书

1.一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(一)引物设计

(1)设计一条通用引物，该引物与人类基因组没有同源性，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物；

(2)针对检测位点，设计一系列基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对或可用于基因片段定量的扩增引物对，包括正向引物和反向引物；

(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；

(二)PCR检测

取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动DNA聚合酶体系组成25μl或50μl的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为：待检测DNA1～3ng/μl，各加尾引物的浓度均为0.3～0.5μmol/L，通用荧光标记引物0.7～0.9μmol/L；PCR反应条件为：预变性95℃11分钟，循环程序为95℃30秒，59～62℃30秒，72℃30秒，共25～35个循环，最后72℃20分钟延伸；

(三)结果检测

取PCR产物0.3～0.75μl，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。

2.根据权利要求1所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于：该方法可实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的--^SEA型，-α^3.7，-α^4.2，--^THAI，α^CSα，α^QSα和α^WSα，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型的检测。

3.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于：步骤(二)中PCR反应条件为：95℃11分钟预变性，循环程序为95℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，28～35个循环，最后72℃20分钟延伸。

4.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于：步骤(一)中，用6-FAM荧光、VIC荧光、NED荧光或PET荧光对通用引物进行标记。

5.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(一)引物设计

(1)设计一条与人类DNA序列同源性较少的DNA片段作为通用引物，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物；

所述通用引物长度为20bp，序列为：5’-CTCGACACGCATCTGCTCAG-3’，用荧光标记于5’端；

(2)针对α地中海贫血的--^SEA型，-α^3.7，-α^4.2，--^THAI，α^CSα，α^QSα和α^WSα，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型序列，设计扩增引物对，引物序列和配对如下：

2.1)针对α^WSα、α^CSα和α^QSα的位点特异性扩增引物：

WS-N-F:5’-AGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3’；

WS-M-F:5’-GAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3’；

CS-N-F:5’-CGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3’；

CS-M-F:5’-CGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3’；

QS-N-F:5’-CTGCGGTGCAAGCCTCCCT-3’；

QS-M-F:5’-CTGCGGTGCACGGCTCACC-3’；

以上引物分别为扩增α^WSα、α^CSα和α^QSα的正向引物，引物名称中，N=扩增正常基因的引物，M=扩增突变基因的引物；

上述引物的反向引物均为：

CQW-co-R:5’-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’；

2.2)针对--^SEA型检测的位点特异性扩增引物：

SEA-α-F：5’-AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’；

SEA-α-R：5’-TGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3’；

2.3)针对--^THAI检测的位点特异性扩增引物：

THAIF-F：5’-ATTCACATACCATACGGTTCAC-3’；

THAIF-R：5’-AATTCCCCTGGACTTGAGTG-3’；

2.4)针对HPFH-SEA检测的跨越断点式扩增引物：

HPFH-F：5’-CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’；

HPFH-M-R：5’-TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3’；

HPFH-W-R：5’-GCAAGAAACGAAGAAACTTCAAGCA-3’；

其中，HPFH-F为公用的正向引物，HPFH-M-R为检测HPFH-SEA突变型的反向引物，HPFH-W-R为检测HPFH-SEA非突变型的反向引物；

2.5)针对DBT检测的跨越断点式扩增引物为：

DBT-M-F：5’-GCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3’；

DBT-R：5’-GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3’；

由于DBT的缺失片段包含了HPFH-SEA缺失片段，所以HPFH–RW可用于做DBT的非突变型对照；

2.6)针对-α^3.7和-α^4.2的可用于基因片段定量的扩增引物：

Y1-Y2-F：5’-CAGGGATGCACCCACTGGCA-3’；

Y1-Y2-R：5’-GGGTGAGGAAGGAAGGGGTG-3’；

(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；

(二)PCR检测

取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动聚合酶体系组成25μl或50μl的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为：待检测DNA1～3ng/μl，各加尾引物浓度均为0.3～0.5μmol/L，通用荧光标记引物0.7～0.9μmol/L；PCR反应条件为：预变性95℃11分钟，循环程序为95℃30秒，59～62℃30秒，72℃30秒，共25～35个循环，最后72℃20分钟延伸；

(三)结果检测

取PCR产物0.3～0.75μl，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。