[发明专利]一种使BCL11B蛋白降解的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白降解的生物技术领域，具体是一种使BCL11B基因的特异性蛋白降解的方法。

背景技术

现有已知的蛋白降解途径是蛋白的SUMO化：维持细胞代谢需要保持蛋白的自我更新。除了在基因指导下，按照中心法则合成蛋白质，细胞内亦存在一套蛋白质降解系统，以维持细胞内蛋白种类和数量的想对稳定。蛋白的泛素降解途径发现于上世纪八十年代，2004年发明者Aaron Ciechanover，Avram Hershko和Irwin Rose共同分享了诺贝尔化学奖。SUMO(Small Ubiquitin一like Modifier)是泛素的一种，可以类似泛素分子一样对需降解的蛋白实施共价修饰，其广泛参与各类细胞事件，包括核质物质运输、细胞凋亡、蛋白降解、细胞对外界刺激的响应、细胞周期等。

目前在人类细胞中发现的SUMO蛋白有三种，分别命名为SUMO-1，SUMO-2和SUMO-3；其中检测加入DOX后2和3结构相似，但和SUMO1差别较大。这三种蛋白约含有100个氨基酸左右，分子量约为12KD。值得注意的是，尽管SUMO和泛素的生物学功能相似，但是一级结构序列差别很大。SUMO1的结构业已解析清楚，NMR分析表明其N端和C端分别位于球形外表的两端，其中含有alpha螺旋和beta折叠片层结构域。

当细胞明确需要降解的蛋白时，SUMO首先被连接到活化酶(E1)上。之后SUMO被转移到共轭酶(E2)上，最后被连接酶连接到待降解蛋白上。对已知的SUMO化蛋白结构分析表明，绝大多数情况下SUMO结合到Ψ-K-x-D/E模体上，其中Ψ为疏水性氨基酸，而SUMO就被共价连接到K(赖氨酸)残基上。

BCL11B是T细胞发育过程中的重要参与基因。T-ALL细胞系Jurkat就高表达这一转录因子。文献报道，敲除BCL11B的小鼠T细胞可以转分化为N K细胞(自然杀伤细胞)。此外，下调BCL11B的表达可以促进细胞凋亡。在T-ALL细胞系中过表达KLF4(Kruppel like factor4)基因可以诱导细胞凋亡，但是KLF4下游通路及凋亡机制尚未详细阐明。

发明内容

我们的研究目的是为了阐明KLF4促进Jurkat细胞系凋亡的机制，提供一种可使BCL11B特异性蛋白降解的新途径，以及更好的下调BCL11B蛋白来实现人T细胞NK细胞(自然杀伤细胞)转化的过程。为了实时监测细胞凋亡进程中各种基因的表达情况，我们构建了DOX(Dxycycline，多西环素)诱导表达KLF4的Jurkat细胞系。当向培养基中加入DOX后，KLF4大量表达导致细胞凋亡，而正常培养时细胞正常生长。

实现上述目的的技术方案为，本发明设计出了一种使BCL11B蛋白降解的新方法如下步骤，

(1)利用慢病毒感染Jurkat细胞，得到可诱导表达KLF4基因的Jurkat细胞群；

(2)向经步骤(1)的得到的Jurkat细胞的RPMI-1640培养基中加入多西环素，Jurkat细胞群的细胞密度为1×10⁶个/ml，多西环素在细胞培养基中的质量浓度为1.5ug/ml，加入的多西环素促使Jurkat细胞开始表达KLF4；

(3)获得表达KLF4的Jurkat细胞蛋白和RNA：在加入多西环素后的10h、20h、30h收集(2)中表达KLF4的Jurkat细胞，再将其裂解获得蛋白质和RNA；

(4)对(3)步获得的蛋白质通过Western Blot检测表达KLF4基因的Jurkat细胞中BCL11B蛋白的SUMO化情况；

(5)对于(3)步获得的RNA，反转录合成cDNA后采用实时定量PCR检测BCL11B基因表达情况，确定BCL11B的特异性蛋白已被降解。

所述步骤(1)中的慢病毒包括rtTA慢病毒和KLF4慢病毒，且两者在慢病毒中的质量比例为1∶1。

所述步骤(1)的具体操作方法包括如下步骤，

(i)用rtTA慢病毒和KLF4慢病毒感染Jurkat细胞；

①取Jurkat细胞1×10⁶个，重悬于900U1RPMI-1640培养液；

②将rtTA慢病毒和KLF4慢病毒各50ul混合均匀后，向其加入聚凝胺，聚凝胺在慢病毒混合液中的质量浓度为10ug/mL；

③将②步的慢病毒混合液加入到①步的培养基中后，在37℃条件下放置30分钟；

④经③处理后的培养基置于24孔板的台式离心机中，以3000rpm离心2小时；