[发明专利]一种使BCL11B蛋白降解的方法

权利要求书

1.一种使BCL11B蛋白降解的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，

(1)利用慢病毒感染Jurkat细胞，得到可诱导表达KLF4基因的Jurkat细胞群；

(2)向经步骤(1)的得到的Jurkat细胞的RPMI-1640培养基中加入多西环素，Jurkat细胞群的细胞密度为1×10⁶个/ml，多西环素在细胞培养基中的质量浓度为1.5ug/ml，加入的多西环素促使Jurkat细胞开始表达KLF4；

(3)获得表达KLF4的Jurkat细胞蛋白和RNA：在加入多西环素后的10h、20h、30h收集(2)中表达KLF4的Jurkat细胞，再将其裂解获得蛋白质和RNA；

(4)对(3)步获得的蛋白质通过Western Blot检测表达KLF4基因的Jurkat细胞中BCL11B蛋白的SUMO化情况；

(5)对于(3)步获得的RNA，反转录合成cDNA后采用实时定量PCR检测BCL11B基因表达情况，确定BCL11B的特异性蛋白已被降解。

2.根据权利要求1所述使BCL11B蛋白降解的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的慢病毒包括rtTA慢病毒和KLF4慢病毒，且两者在慢病毒中的质量比例为1∶1。

3.根据权利要求1所述使BCL11B蛋白降解的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作方法包括如下步骤，

(i)用rtTA慢病毒和KLF4慢病毒感染Jurkat细胞；

①取Jurkat细胞1×10⁶个，重悬于900U1RPMI-1640培养液；

②将rtTA慢病毒和KLF4慢病毒各50ul混合均匀后，向其加入聚凝胺，聚凝胺在慢病毒混合液中的质量浓度为10ug/mL；

③将②步的慢病毒混合液加入到①步的培养基中后，在37℃条件下放置30分钟；

④经③处理后的培养基置于24孔板的台式离心机中，以3000rpm离心2小时；

⑤将离心后的培养基放回培养箱培养24h后，从取出Jurkat细胞800rpm离心10分钟，弃掉上清液后，再向细胞中加入1mL的RPMI-1640培养液继续培养；

⑥经⑤步的Jurkat细胞在培养基上培养48小时后，用显微镜观察GFP荧光，并作细胞流式分析，确定rtTA慢病毒和KLF4慢病毒已经将Jurkat细胞感染；

(ii)分选出已被慢病毒感染的Jurkat细胞，将其进行扩大培养得到可诱导表达KLF4基因的Jurkat细胞群：

①将(i)步处理过的Jurkat细胞重悬于含质量分数为2％的PBS中；

②将上步的PBS液置于BD FACS ARIAII流式细胞仪中，调节流式细胞仪的收集细胞速度为3000～5000个细胞/s，选择无菌分选，收集GFP阳性的Jurkat细胞，GFP阳性的细胞为已被慢病毒感染的Jurkat细胞，即为可诱导表达KLF4基因的Jurkat细胞；

③将上步收集到的已被慢病毒感染的Jurkat细胞离心，800rpm离心5min，用含质量浓度为10％青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基洗三遍；

④经步骤③处理后的细胞进行扩大培养，扩大培养的条件：用RPMI-1640培养基，温度37度，体积浓度为5％的CO₂，得到可诱导表达KLF4基因的Jurkat细胞群。

4.根据权利要求1所述检测BCL11B蛋白降解的方法，其特征在于，所述步骤(3)中对表达KLF4的Jurkat细胞裂解获得蛋白质，具体操作方法是：

①表达KLF4的Jurkat细胞通过RPMI-1640培养基培养后，以1000转/分钟的速度离心5分钟，离心后将细胞用胰酶消化，再用PBS缓冲液清洗两遍收集，立即置于冰上保存；

②向①步处理过的Jurkat细胞中先加入100ul的RIPA裂解液，再加入1ul的PMSF，将其置于冰上静置裂解Jurkat细胞30分钟；

③经②步裂解后离心，离心的温度为4℃、速度为13000rpm、离心时间为30分钟，离心后除去沉淀和裂解的碎片；

④经③步离心后的上清液中含有裂解出的蛋白质，然后在上清液中加入上样缓冲液，混匀后，沸水煮沸10min；

⑤经④步处理后的裂解蛋白上清液经13000rpm离心5min后，备用于下步检测。