[发明专利]一种高纯度重组人BAFF的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种高纯度重组人BAFF的制备方法，以及对应的优化后人BAFF核苷酸序列，及用于扩增该序列的引物。

背景技术

B淋巴细胞刺激因子（Bcell activating factor belonging to the TNF family,BAFF）是肿瘤坏死因子（TNF）的成员，能与B淋巴细胞特异性结合并诱导其增殖、成熟、分化并分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白。人BAFF（hBAFF）属II型跨膜蛋白，全长285个氨基酸。

有研究表明系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎（RA）等自身免疫性疾病与BAFF的过量表达有关，目前也有相关技术通过研究BAFF拮抗剂药物或抗BAFF血清治疗相关疾病。其中涉及到通过获得大量可溶性BAFF用于研究BAFF与人类自身免疫的机理，以及用作免疫治疗的必要组分。

由于BAFF主要以不可溶的包涵体形式存在，在提取过程中存在困难，利用传统亲和层系纯化的方法获得的BAFF量非常小。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用尿素逐步变性除杂法获得高纯度重组人BAFF的方法，本发明的另一个目的是提供一种功能区经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF核苷酸序列，本发明还有一个目的是提供用于扩增上述功能区核苷酸序列的引物。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF基因，其用于表达134-285氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。

所述SEQ ID NO.01对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

一种高纯度重组人BAFF的制备方法，该方法将优化后的人BAFF功能区的核苷酸序列载入原核表达载体，转入原核细胞进行培养后诱导表达，离心破碎后，对沉淀包涵体采用尿素逐步变性法除杂，获得高纯度的重组人BAFF蛋白；

其中，所述优化后的人BAFF核苷酸序列的功能区如SEQ ID NO.01所示。

人BAFF134-285氨基酸为短可溶功能区（sBAFF），通过相关引物和酶将该片段载入原核表达载体中。具体地说，用于载入SEQ ID NO.01的原核表达载体为pET28a质粒，用于表达载体的原核细胞为DH5a受感态细胞。所用引物BAFF-F和BAFF-R如SEQID NO.03和SEQ ID NO.04所示，即：

BAFF-F:CGCCATATGGCTGTTCAGGGTCCGGAAGAAAC，

BAFF-R:CCCAAGCTTTTACAGCAGTTTCAGAGCACCG，

其中，划线部分分别为NdeI和HindIII的酶切位点。切断后利用连接酶连接，即构建了pET28a-sBAFF载体，然后接种到DH5a受感态细胞中。

将上述含有pET28a-sBAFF的DH5a接种到LB液体培养基中预培养，然后接种到自动诱导培养基中，加入卡那霉素后振摇培养。

其中，所述自动诱导培养基包括：

Buffer III(50X每1000ml+Buffer-III:20ml)

K₂HPO₄         15g

KH₂PO₄         10g

(NH₄)₂HPO₄     25g

H₂O到100ml；

Buffer II(20X Inducer每1000ml+Buffer-II:50ml)

Lactose     136g

Glycerol    100g(84ml)

MgSO₄       1g

H₂O到1000ml；

Buffer I(1000X每1000ml+Buffer-I：1-10ml)

Glucose     100g

MgSO₄       5%

H₂O到1000ml。