[发明专利]一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种手性胺，尤其是涉及一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法。

背景技术

手性胺是重要的医药和精细化工中间体，也可用作金属手性配体和手性助剂的手性源[Applied Organometallic Chemistry,2011,25:110-116]，催化羰基的不对称还原。手性胺还可以作为手性拆分试剂用于外消旋体拆分。手性胺可通过化学合成和生物催化制备。手性胺的化学制备方法主要有：氨基酸或其衍生物的还原、醛或酮与亚胺的偶合以及环氧化合物的氨基化开环等。生物法制备手性胺主要通过酶催化拆分或不对称还原实现。

用于制备手性胺的酶主要有脂肪酶、转胺酶和氧化还原酶。脂肪酶（Lipase）可催化拆分消旋胺获得手性胺，理论产率为50%，并存在后续分离的问题[Journal of the American Chemical Society,2010,132:14179-14190]。利用转氨酶（Transaminases）催化羟酮发生氨基转移反应是目前制备手性氨基醇的主要方法。转氨酶可催化氨基供体（氨基酸或胺）与氨基受体（酮）之间氨基转移。该反应是可逆反应，由于生成的酮和胺均对转胺酶有较严重的抑制作用，必须除去产物酮以降低其对酶抑制，促使反应正向进行，时空产率较低[Chemical Communications,2010,46:5569-5571]。

催化酮基不对称还原胺化获得手性胺，并以NAD(P)H为辅酶的胺脱氢酶，是理想的制备手性氨基醇的生物催化剂，其反应路线简洁，易实现辅酶再生。Abrahamson等对来源于Bacillus stereothermophilus的亮氨酸脱氢酶进行多轮定点突变，获得新型胺脱氢酶，可选择性还原甲基异丁基酮为(R)-1,3-二甲基丁基胺。该酶催化不对称胺还原，转化率可达92%，活性为0.69U/mg,产物ee值为99.8%[Angewandte Chemie International Edition.201251:3969-3972]。Itoh等人从Streptomyces virginiae IFO12827中分离纯化得到依赖辅酶NADH的胺脱氢酶，在pH10的条件下催化系列羟酮还原胺化生成氨基醇，pH7时反方向催化氨基醇生成相应的羟酮[Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic,2000,10:281-290.]。但该酶的反应选择性尚属较低，且无基因和蛋白结构等信息的报道。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的胺脱氢酶的菌株是实现手性胺有效制备的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法。

本发明包括以下步骤：

1）细胞液制备：将菌种接入216L培养基中培养，再将培养后获得的发酵液离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；

2）全细胞催化反应：在步骤1）得到的细胞液中，加入酮作为底物，再加入氨基供体和辅助底物，用于辅酶循环再生，利用细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺。

在步骤1）中，所述菌种为基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)，基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)从中国海洋微生物菌种保藏管理中心获得，该中心的保藏编号为MCCC NO.1A06062；所述将菌种接入216L培养基中培养的菌种接种量可为1%；所述216L培养基的组成为10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L柠檬酸钠,0.2g/LNH4NO3,1.0g/L NaAc，用海水配制；所述培养的条件可为：起始pH7.0，装液量体积分数为10%，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养时间72h；所述离心可采用冷冻离心机，离心的条件可为4℃，10000rpm，15min，获得细胞；所述用缓冲液重悬、洗涤可弃上清液，缓冲液重悬，洗涤后离心，重复操作3次；所述细胞液的浓度可为0.025～100g/L；所述缓冲液可选自0.01～0.2mol/L的pH为7～13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾等中的至少一种，优选pH9的Tris-盐酸缓冲液。