[发明专利]鉴别空肠弯曲菌及大环内酯类耐药突变的荧光PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于动物源细菌耐药性检测技术领域。与多重荧光定量PCR方法有关。本发明具体涉及一种利用荧光定量PCR法鉴别空肠弯曲杆菌及其大环内酯类耐药相关突变，在同一反应体系中，不仅可以对空肠弯曲杆菌进行种属鉴定，而且可以同时检测空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药靶基因23S rDNA和rplD基因的变异情况。

背景技术

弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter.lari)等，均为革兰氏阴性、高度可运动、微需氧性和嗜热性细菌。其中，空肠弯曲杆菌广泛存在于各种动物体内，可以通过被污染的水源、生奶和未完全加工熟的肉类食品感染人类，引起人和动物的多种疾病，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要病原菌(Moore et al.，2006)。空肠弯曲杆菌作为一种微需氧菌，对培养条件要求较苛刻，常规的分离培养和生化鉴定耗时费力、灵敏度不高。已有的分子生物学的研究发现，空肠弯曲杆菌的16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA、flaB)、含铁细胞转运相关蛋白基因(ceuE)、细胞致死性膨胀毒素基因(cdt基因)、外膜纤维结合蛋白基因(cadF)、外膜蛋白基因(omp50)以及VS1基因等都可以用作特异性鉴别弯曲杆菌的靶基因。其中，VS1基因特异性存在于空肠弯曲杆菌中。2003年，阳成波等(Yang et al.，2004)根据空肠弯曲菌的VS1基因中的保守片段设计了一对特异性引物，建立一种快速从食品和水中检测空肠弯曲杆菌的PCR方法。检测结果显示该PCR方法只对空肠弯曲杆菌能扩增出358bp的片段，而对结肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均不能扩增出该片段，检测灵敏度达8CFU/ml，特异性与常规生化检查是一致的。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准-食品中多种致病菌快速检测-PCR方法中所用的特异性引物也是根据空肠弯曲菌特有的靶序列VS1基因设计的，长度也为358bp。

大环内酯类药物，是空肠弯曲杆菌感染的首选药物之一。随着此类药物，如红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素和替米考星等，在兽医和人医临床中的广泛应用和不合理使用，弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性问题已经引起了世界的广泛关注。23S rRNA V区和核糖体蛋白L4、L22上的位点突变是介导空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物耐药性的主要途径(Payot et al.，2006)。其中23S rRNA V区的位点突变通常导致空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的高水平耐药(红霉素MIC≥256μg/ml)，核糖体蛋白L4和L22上的位点突变往往出现在中水平耐药(红霉素MIC为8～128μg/ml)菌株中。目前用于检测空肠弯曲杆菌对大环内酯类耐药性的方法有：PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链探针反向杂交(PCR-LiPA)、焦磷酸测序、错配PCR(MAMA-PCR)和实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)等。

Niwa等(Niwa et al.，2001)在2001年建立了一种PCR-LiPA方法，他们利用10个寡核苷酸探针来检测大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的23S rDNA上2072、2073和2074位点的突变，检测结果与DNA测序结果一致，准确性较高。但是该方法需经过引物标记、PCR扩增、寡核苷酸探针胶条的制备、反向杂交和酶联免疫显色等多个步骤，工序多，耗时长，操作繁琐，不够方便快捷。

Vacher等(Vacher et al.，2003)于2003年建立了一种用于检测空肠弯曲杆菌23S rRNA上耐药相关突变的PCR-RFLP方法。他们先用PCR扩增出空肠弯曲杆菌核糖体23SrRNA V区的一段316bp的片段，然后用BsaI和BceAI两种酶进行切割，产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的长度来判断是否存在耐药相关突变。该方法需要先后经过PCR扩增、特异性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳三个步骤，操作相对比较繁琐，耗时长。

Alonso等(Alonso et al.，2005)在2005年建立了一种MAMA-PCR方法，用于检测空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌中23S rRNA上与红霉素耐药相关的突变。该方法比传统测序方法和PCR-RFLP成本低、耗时短，并且简便易行。但是由于无法摆脱普通PCR最后要用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的步骤，因此无法避免EB(DNA显色剂)对人体的伤害。