[发明专利]鉴别空肠弯曲菌及大环内酯类耐药突变的荧光PCR方法

权利要求书

1.一种检测空肠弯曲杆菌及其大环内酯类耐药位点突变的多重荧光定量PCR方法，其特征在于：利用特异性的荧光定量PCR反应液和荧光定量PCR反应条件，快速鉴别空肠弯曲杆菌及检测空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物耐药靶基因的位点突变，所述的靶基因位点突变分别为空肠弯曲杆菌23SrRNA基因第2074和2075位突变，核糖体蛋白L4编码基因rplD 170位和221位突变；

所述的荧光定量PCR反应液中分别含有VS1引物对和荧光探针组合，23S rRNA引物对和荧光探针组合，以及rplD的引物对和荧光探针组合：

①VS1引物对和荧光探针组合

正向引物VS1-RT-F，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：8所示；

反向引物VS1-RT-R，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：9所示；

VS1-MGB荧光探针，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：10所示；

利用引物对VS1-RT-F和VS1-RT-R扩增得到214bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，该片段位于空肠弯曲杆菌特异性鉴别基因VS1全序列的931～1144位；VS1-MGB荧光探针的5’端以HEX荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团标记，并连接小型凹槽结合物MGB基团，以提高探针的退火温度；利用引物对VS1-RT-F和VS1-RT-R及探针VS1-MGB组合对空肠弯曲杆菌进行特异性种属鉴别；

②23S rRNA引物对和荧光探针组合

正向引物23S-RT-F，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物23S-RT-R，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示；

23Sr RNA-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；

利用引物对23S-RT-F和23S-RT-R扩增得到96bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；该片段位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因23S rRNA基因全序列的第2020～2115位；23SrRNA-MGB荧光探针的5’端以TAMRA荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团和MGB基团标记，该探针与野生型23S rRNA基因全序列的第2068～2080位序列结合，从而检测23S rRNA基因全序列第2074和2075位是否发生突变；

③rplD的引物对和荧光探针组合

正向引物rplD-RT-F，其DNA序列如SEQ ID NO：4所示；

反向引物rplD-RT-R，其DNA序列如SEQ ID NO：5所示；

170A-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：6所示；

221A-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示；

利用引物对rplD-RT-F和rplD-RT-R扩增得到134bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，该片段位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因rplD全序列的第120～253位；170A-MGB和221A-MGB探针5’端以FAM荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团和MGB基团标记，利用这两条探针分别对rplD基因全序列第170位和221位的基因突变进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应液总体积为25μL，其包含Taq酶1～5U，MgSO₄0.75～2.5mM，dNTPs75～250μM，6条引物VS1-RT-F和VS1-RT-R、23S-RT-F和23S-RT-R及rplD-RT-F和rplD-RT-R各0.2～0.6μM，VS1-MGB探针和23SrRNA-MGB探针各为0.1～0.45μM，170A-MGB探针和221A-MGB探针各为0.1～0.45μM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应条件为：94℃/95℃10秒～5min1个循环；94℃/95℃5～10秒、56～60℃20～50秒，共计30～50个循环。