[发明专利]基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法。

背景技术

人体50％以上的蛋白质都带有糖基化修饰。糖基化参与了几乎所有重要的生命过程，例如受精、发育、免疫应答、细胞间识别及通讯等。其中，蛋白质N-糖链的组成和结构对糖基化蛋白质的构象、功能以及与其它生物分子的相互作用都具有巨大的影响。同时也有研究表明，多种疾病的发生发展过程中都伴随着蛋白质N-糖链组成和结构的改变，如肿瘤、自身免疫疾病、糖尿病等。因此，高通量、高灵敏度的N-糖链检测技术对于阐明糖链在各个生理过程和疾病发生发展中的作用及对于临床诊断标志物的发现显得尤为重要。但是N-糖链本身含量有限，并具有高度微不均一性，同时易受高丰度蛋白质、肽段、核酸及盐类等的干扰，导致质谱分析时信号易受抑制。而且，由于糖链是一种多羟基化合物，其疏水性差及离子化效率低等特点进一步加剧了其质谱检测的难度。

基于以上原因，发展高效的N-糖链富集及检测技术，对于复杂生物样品中的N-糖链分析是十分必要的。凝集素亲和色谱、石墨柱固相萃取及亲水相互作用色谱是常见的糖链富集方法。然而，每种凝集素只对特定的糖型具有富集作用，难以实现全部糖链的富集检测；其次，虽然石墨柱和亲水色谱可以实现糖链的无差异化富集，但是由于其与糖链的作用属于物理相互作用，特异性较差，常伴有一些亲水性杂质(例如肽段、核酸和盐类)的共洗脱。此外，对糖链进行化学衍生化，提高其疏水性和结合质子能力，可以提高其在质谱中的信号响应。然而，现有衍生化方法往往需要较繁杂的操作步骤，导致不必要的样品损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理方法。

本发明所提供的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理方法，包括下述步骤：

1)使糖蛋白N-糖链酶解释放；

2)将石墨烯、含酰肼或氨基的芳香族化合物和经步骤1)处理后的待富集的N-糖链一起孵育，得到了富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品。

其中，步骤1)中使糖蛋白N-糖链酶解释放的方法具体如下：将糖蛋白溶于碳酸氢铵溶液或磷酸盐缓冲液中，并加热变性，待冷却后加入肽N-糖苷酶F进行酶解反应，使N-糖链完全释放。

所述糖蛋白包括标准糖蛋白和含糖蛋白的复杂生物样品；所述碳酸氢铵溶液为pH＝6.0-9.0、浓度为25-500mM的碳酸氢铵溶液；所述磷酸盐缓冲液为pH＝6.0-9.0的磷酸盐缓冲液；所述糖蛋白的浓度为1mg/mL；所述加热变性的温度为90-100℃、时间为3-20min；所述肽N-糖苷酶F的加入量为：每100μg糖蛋白加入1-100U肽N-糖苷酶F；所述酶解反应条件为：25-38℃水浴中孵育2-20h。

标准糖蛋白N-糖链的酶解释放。以去唾液酸胎球蛋白为例，将其溶解于50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)中，浓度为1mg/mL。之后95℃加热变性10min，待冷却后按照1U肽N-糖苷酶F(PNGase F)：100μg标准糖蛋白的比例加入适量PNGase F，在37℃水浴中孵育16h，将N-糖链完全释放。之后将所得样品冻存于4℃条件下备用。

复杂蛋白质样本(如离体的人血浆或胎球蛋白)中糖蛋白N-糖链的酶解释放。以人血浆为例：将人血浆样品用50mM碳酸氢铵(pH＝8.0)或磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)稀释至蛋白质浓度约为1mg/mL，之后95℃加热变性10min，待冷却后以1U PNGase F：100μg蛋白质的比例加入所需的酶，37℃水浴16h，酶解糖蛋白释放糖链。

步骤2)中所述含酰肼或氨基的芳香族化合物中的芳香基部分可以含有1、2、3或3个以上的苯环，具体为苯、联苯、菲或芘。所述含酰肼或氨基的芳香族化合物优选酰肼类芳香化合物，具体可为芘丁酸酰肼(PBH)或苯甲酰肼等。所述的PBH具有酰肼官能团，可以糖链还原端的醛基进行共价偶联；同时，芘环也可以通过与石墨烯的π-π共轭相互作用吸附于其上，实现对微量糖链的一步法富集-衍生化。

步骤2)中所述石墨烯的加入量对于芳香族化合物是过量的。以PBH为例，石墨烯和PBH的配比可以大于等于1mg∶15nmol。

步骤2)中所述芳香族化合物对于所需富集糖链的量也是过量的。以PBH为例，PBH和糖链的摩尔配比可以大于等于50∶1。