[发明专利]基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理及MALDI-TOF-MS分析方法

权利要求书

1.一种糖蛋白N-糖链一步富集-衍生化方法，包括下述步骤：

1)使糖蛋白N-糖链酶解释放；

2)将石墨烯、含酰肼或氨基的芳香族化合物和经步骤1)处理后的待富集的N-糖链一起孵育，得到了富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品。

2.一种寡糖一步富集-衍生化方法，包括下述步骤：将石墨烯、含酰肼或氨基的芳香族化合物和待富集的寡糖一起孵育，得到了富集了衍生化寡糖的石墨烯样品。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含酰肼或氨基的芳香族化合物中的芳香基部分含有1、2、3或3个以上的苯环，具体为苯、联苯、菲或芘；

所述含酰肼或氨基的芳香族化合物为芘丁酸酰肼或苯甲酰肼。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述石墨烯与含酰肼或氨基的芳香族化合物的配比大于等于1mg∶15nmol；所述含酰肼或氨基的芳香族化合物和N-糖链的摩尔比大于等于50∶1；所述含酰肼或氨基的芳香族化合物和寡糖的摩尔比大于等于50∶1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述孵育在含有酸性催化剂或者碱性催化剂的有机溶剂中进行；所述酸性催化剂具体选自下述至少一种：甲酸、乙酸、三氟乙酸和三氟甲酸；所述碱性催化剂具体选自下述至少一种：碳酸氢铵、氨水和氢氧化钠；

所述有机溶剂选自下述至少一种：甲醇、四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜，优选为甲醇；

所述孵育优选在含乙酸的有机溶剂中进行；所述有机溶剂中乙酸的质量浓度为0.1％-10％，优选为0.5％。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为50-95℃，优选为90℃；所述孵育的时间为10-60min，优选为60min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中使糖蛋白N-糖链酶解释放的方法具体如下：将糖蛋白溶于碳酸氢铵溶液或磷酸盐缓冲液中，并加热变性，待冷却后加入肽N-糖苷酶F进行酶解反应，使N-糖链完全释放。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述糖蛋白为标准糖蛋白或含糖蛋白的复杂生物样品；所述碳酸氢铵溶液为pH＝6.0-9.0、浓度为25-500mM的碳酸氢铵溶液；所述磷酸盐缓冲液为pH＝6.0-9.0的磷酸盐缓冲液；所述糖蛋白的浓度为1mg/mL；所述加热变性的温度为90-100℃、时间为3-30min；所述肽N-糖苷酶F的加入量为：每100μg糖蛋白加入1U肽N-糖苷酶F；所述酶解反应条件为：25-38℃水浴中孵育2-20h。

9.一种对糖蛋白N-糖链进行MALDI-TOF-MS分析的方法，包括下述步骤：

1)按照权利要求1-8中任一项所述的方法对糖蛋白N-糖链进行一步富集-衍生化，得到富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品；

2)对所述富集了衍生化N-糖链的石墨烯样品分别用去离子水及甲醇洗涤，然后将洗涤后的样品用二甲基甲酰胺洗脱后进行MALDI-TOF-MS分析。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述MALDI-TOF-MS分析的质谱条件为：正离子反射模式；加速电压20KV，扫描范围为m/z1000-4000，激光能量为6000；所用的基质为含三氟乙酸的2，5-二羟基苯甲酸溶液，所述溶液中的溶剂为乙腈与水体积比1∶1的混合溶剂，所述溶液中三氟乙酸的质量浓度为0.1％；所述溶液中2，5-二羟基苯甲酸的浓度为5mg/mL。