[发明专利]一种具自溶功能的重组菌及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种具自溶功能的重组菌及其制备方法与应用。 

背景技术

随着病原菌耐药性特别是多重耐药性的日益严重，抗菌药作用新靶点的发现和新型抗菌药物的研发显得尤为重要。众多病原菌的致病基因受到群体感应(QS)的调控，包括毒力因子、黏附因子以及介导病原菌抵抗宿主免疫和药物的相关基因。在QS系统中调控相关靶基因的表达的关键是QS系统中信号分子的浓度，如有效降低信号分子的浓度，就可以调控一些致病菌的致病性。而具有降解信号分子功能的淬灭酶就是其中一种重要的潜在生物防治手段。 

E7裂解蛋白是产大肠杆菌素细胞中SOS响应系统中的一个关键成分，其功能是在压力环境下输出细菌素到细胞外空间。最近的研究已表明，E7裂解蛋白造成内膜伤害，可能与激活用于外膜修饰的外膜磷脂酶A有关。 

由于许多的淬灭酶来源于细菌，因此在进行基因工程研究的时候多数采用细菌表达载体进行研究，其中大肠杆菌表达系统研究的最为清楚。而目前大肠杆菌工程菌存在目标蛋白分泌表达量低、胞内表达需破壁工序增加成本而限制其工业化的这种现状。 

发明内容

本发明的目的是提供一种重组菌的制备方法，利用该方法获得的重组菌具有自溶功能，可减少重组菌的破壁工序，降低目的蛋白的生产成本。 

本发明所提供重组菌的制备方法包括：将E7裂解蛋白的编码基因和目的蛋白的编码基因导入出发菌中，获得重组菌。 

在上述方法中，所述E7裂解蛋白可为序列表序列2所示蛋白；和/或，所述目的蛋白可为淬灭酶； 

所述淬灭酶具体可为序列表序列5所示的蛋白。 

在上述方法中，所述E7裂解蛋白的编码基因可为序列表序列1的第52位至第195位所示基因； 

和/或，所述目的蛋白编码基因为序列表序列4的第9位至第818位所示基因。 

在上述方法中，所述E7裂解蛋白编码基因和目的蛋白编码基因通过重组载体C导入所述出发菌中获得工程菌； 

所述重组载体C按照包括如下步骤的方法制备： 

在质粒pET-28a(+)T7启动子上游插入所述E7裂解蛋白编码基因表达盒获得重组载体B；在所述重组载体B的所述T7启动子下游的多克隆位点处插入所述目的蛋白编 码基因，获得所述重组载体C；所述E7裂解蛋白编码基因表达盒的启动子具体可为T7启动子。 

所述重组载体C进一步具体可按照包括如下步骤的方法制备： 

在质粒pET-28a(+)的XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入序列表序列1的第17位至第195位核苷酸所示的DNA片段获得重组载体A，在所述重组载体A的SphⅠ和BglⅡ酶切位点之间插入序列表序列3的第16位至第398位核苷酸所示的DNA片段获得重组载体B，在所述重组载体B的EcoR I和Not I酶切位点之间插入序列表序列4的第9位至第818位核苷酸所示的DNA片段获得所述重组载体C。 

在上述方法中，所述出发菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)，具体可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。 

本发明保护上述任一所述方法制备得到的重组菌。 

本发明保护上述任一所述方法制备得到的重组菌在制备所述目的蛋白中的应用。 

本发明还提供一种制备目的蛋白的方法，包括如下步骤：将上述任一所述方法制备得到的重组菌用发酵培养基振荡培养至OD₆₀₀=1.0，然后加入IPTG至终浓度为0—1mmol/L（如0、0.25、0.5或1mmol/L），于30℃、180rpm、旋转半径为1.3cm的条件下继续震荡培养1—24小时（如1、2、4、8、12、24小时），获得所述目的蛋白； 

当所述重组菌的出发菌为大肠杆菌时，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度分别为蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4ml/L、KH₂PO₄0.231g/L、K₂HPO₄1.254g/L和葡萄糖5g/L。 

所述重组载体B也属于本发明的保护范围，所述重组载体B可作为构建目的蛋白表达的出发载体，以便于制备所述重组菌并生产所述目的蛋白。