[发明专利]一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞的分离、培养的方法，特别是指一种一种胎盘源母体间充质干细胞的分离、制备的方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点：1)造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干/祖细胞，MSCs与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入。2)免疫调控。MSCs不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义。3)基因治疗。由于MSCs体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景。4)多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。

目前，从胎盘、脐带获得间充质干细胞常用多步多酶消化法，如：卢国辉等《卢国辉，张世忠，陈强,等.人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究.南方医科大学学报，2011;31(2)：262-265》采用双酶消化加密度梯度离心法从足月胎盘底蜕膜中分离出呈克隆样贴壁生长细胞，表达典型的MSCs表面抗原，但由于胎盘组织比较复杂，同时存在母体和胎儿的细胞，卢国辉等并未检测所得到的为母体细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于一种对细胞损伤小、更快的得到完全来自母体的胎盘源间充质干细胞的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：

（1）胎盘源母体间充质干细胞的分离：取胎盘小心剥离底蜕膜组织，先用机械方法处理成小于0.5-1平方厘米的小片，用组织块1-5倍体积的trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块0.3-0.5小时，后清洗去除消化液，该步目的为了去除小组织块表面可能粘连的胎儿组织。我们再将第一步消化后的残留组织块，再用组织块1-5倍体积的trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块0.5-1小时，得到消化后的混合液，将混合液用滤网过滤得到单细胞为主的悬液；将细胞悬液离心；通过分两步处理，我们可以得到很纯的母体细胞。

（2）胎盘源母体间充质干细胞的培养：将上述细胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行原代细胞培养。所用培养基为无血清培养基，细胞培养到80-90%融合时，用trypLE^TM消化，按分种率1：2--1：10接种到新培养瓶中培养。经过数次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代细胞库冻存到液氮中长期保存。

本发明的优点：

本发明提供一种对细胞损伤小、更快的得到完全来自母体的胎盘源间充质干细胞的制备方法，与现有技术相比至少有以下优点：

1）本发明的方法更加简便快捷，并能获得完全来自母体的细胞：

本发明的方法只使用了二步消化的方法，更加方便和快捷，较卢国辉等的多步多酶消化法的方法简单，且能得到完全来自母体的细胞。

由于胎盘由羊膜、叶状绒毛膜（也称丛密绒毛膜）和底蜕膜构成。羊膜：构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的最内层，羊膜是附着在绒毛膜板表面的半透明膜；叶状绒毛膜：构成胎盘的胎儿部分，占妊娠胎盘的主要部分；底蜕膜：构成胎盘的母体部分，占妊娠足月胎盘很小部分，底蜕膜表面覆盖一层来自固定绒毛的滋养层细胞与底蜕膜共同形成绒毛间隙的底，称为蜕膜板，从此板向绒毛膜方向伸出一些蜕膜间隔，一般不超过胎盘全层厚度的2/3，将胎盘母体面分成肉眼可见的20个左右母体叶。

由于胎盘结构的复杂性，使用现有技术的多步多酶消化法会导致分离过程污染母体或胎儿的细胞，获得的异源细胞可能会引起人体免疫反应等问题，而本发明的方法则可以获得来源单一的组织干细胞，如本发明后续实施例所示，通过使用短串联重复序列（STR）分析，（称DNA指纹图谱，能灵敏的检测出细胞交叉污染），可以证明即使在分离如胎盘这样多重来源组织细胞，本发明的方法也可以获得完全来自母体的细胞。