[发明专利]一种利用重组Bacillus subtilis克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法

说明书

技术领域

一种利用重组Bacillus subtili克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法，尤其是一种安全高效的可用于食品工业的脂肪酶的表达方法，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

脂肪酶(Lipase，全称Triacylglycerol acylhydrolase)EC3.1.1.3，是一类特殊的酯键水解酶。能催化水解三酰甘油为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯以及甘油，其天然底物一般是不溶于水溶液的长链脂肪酸酰基酯。脂肪酶在自然界中广泛存在，不仅有参与新陈代谢的重要的生理作用，而且有很大的工业价值，包括一些特殊有机物的合成，脂肪和油类的水解，食品工业发展中香料的改进，以及化学分析等。脂肪酶有很好的工业应用前景，一般是通过产胞外脂肪酶的微生物如细菌、真菌、酵母、放线菌等获得的，它在有机化学制品的加工处理、去垢剂的生产、生物表面活性剂的合成、牛奶工业、农用化学品工业、造纸、营养学、化妆品、制药工业等很多方面有广泛应用，还能促进脂类垃圾及聚亚安酯的降解。 

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。目前脂肪酶的生产方法有三种： 

(1)提取法：自动植物器官或组织中提取酶； 

(2)化学合成法：通过分析酶的氨基酸组成顺序，然后用化学方法合成； 

(3)发酵法：利用微生物的生命活力，通过人工控制而获得人们所需的酶。 

微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、温度范围和更好的底物专一性，被广泛应用于传统和新型工业催化领域中。目前脂肪酶主要在食品加工、日化用品等行业取得迅猛发展，而在手性药物拆分、生物柴油方向研究较少。 

粘质沙雷氏菌可以分泌胞外脂肪酶，并且研究表明(Zhang-De Long，Jian-He Xu，Li-Li Zhao.Overexpression ofSerratia marcescens lipase in Escherichia coli for efficient bioresolution ofracemic ketoprofen.Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic47(2007)105-110)这种脂肪酶具有较高的立体选择性，如能够专一性的拆分地尔硫卓合成过程中的关键中间体消旋反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(MPGM)，得到(-)-MPGM，后者可进一步合成手性顺式(+)地尔硫卓。同时有研究显示粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在大肠杆菌中表达后具有较高的甲醇耐受性。说明粘质沙雷氏菌的脂肪酶可以很好的应用于手性药物合成及生物柴油领域，同时为了拓展其在食品加工等领域的应用，我们对其进行了在食品安全性佳及工业化发酵条件简单的枯草芽孢杆菌基因高效重组表达，为脂肪酶催化剂的最终形成及工业化奠定了坚实的技术基础。 

本发明通过质粒pMA-5，实现了粘质沙雷氏菌脂肪酶在枯草芽孢杆菌168中的过量表达，经过单因子实验和正交试验对重组菌的培养基组分及培养条件进行了优化，使其酶活达98.6U/mL，为原始菌酶活的12倍左右。同时枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，是微生物脂肪酶发酵工业中的优质潜在生产菌株。 

发明内容

本发明的目的在于提供：一种通过基因工程手段来获得具有安全高效发酵生产粘质沙雷氏菌脂肪酶能力的微生物的方法。 

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株发酵生产粘质沙雷氏菌脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌，通过PCR及酶切验证，筛选阳性重组子，对重组的枯草芽孢杆菌进行发酵条件优化，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力。本发明成功构建了一株高产脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌株并优化了其发酵条件，其脂肪酶活力较出发菌株有极大提高。 

重组菌株构建方法： 

(1)脂肪酶(lipA)基因全序列的克隆 

根据GENBANK网站公布的Serratia marcescens lipA基因序列以及pMA-5质粒上的酶切位点设计lipA基因引物。以制备的粘质沙雷氏菌染色体DNA为模板，通过PCR扩增出lipA全序列。 

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP2μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min。