[发明专利]一种利用重组Bacillus subtilis克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法

权利要求书

1.一种重组表达载体pMA5-lipA，其特征是：

通过PCR技术获得来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶(lipA)基因，与克隆载体pMD-18T相连，获得该基因的大量克隆，经双酶切，片段纯化后与表达载体pMA5连接。

2.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征是：

将权利要求1中构建的重组载体pMA5-lipA，用化学转化法转化模式菌株Bacillus subtilis168，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA5-lipA，lipA得到成功表达。

3.一种重组枯草芽孢杆菌发酵优化，其特征是：

通过单因素实验和正交实验，确定了有利于菌体量及脂肪酶产量的最优碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐的种类及其浓度，进一步对培养条件pH、接种量的影响进行了分析，确定最佳pH及接种量。

4.将权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌发酵产脂肪酶的方法，其特征是：将该菌株以2％接种量接种于50mL LB培养基中，培养36h，离心取上清，菌体洗涤两次，用适当的PBS(pH7.5)缓冲液悬浮，超声波破碎细胞，总酶活约为33.24U/mL，约是出发菌粘质沙雷氏菌JNS3-9脂肪酶酶活8.57U/mL的4倍。

5.将权利要求3所述重组枯草芽孢杆菌发酵产脂肪酶的优化方法，其特征是：发酵培养基成分为蔗糖35g/L，玉米浆27.5g/L，硫酸铵1.25g/L，氯化钙4g/L，接种量4％，初始pH7.0，在此培养条件下33h重组菌B.subtilis168/pMA5-lipA的脂肪酶产量达到98.6U/mL，约是出发菌8.57U/mL的12倍。