[发明专利]非天然双功能糖及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学糖生物学领域，尤其涉及非天然双功能糖的合成及其在细胞表面标记中的应用。

背景技术

唾液酸具有重要的生物学功能，在抗炎、抗肿瘤、抗病毒治疗等方面发挥着极为重要的作用，但是由于传统的生化手段及基因技术的局限性，人们对唾液酸在细胞层面的研究相对滞后。近年来，通过糖的生物代谢途径引入化学探针的策略备受科学家们的青睐。其以化学生物学方法为切入点，通过对非天然基团的设计可以在细胞表面引入生物正交反应基团，并通过生物正交反应在活细胞条件下引入探针分子，进而在活细胞的生理条件下从分子水平揭示特定糖基化功能的机理。唾液酸的N-Acetyl和9号位可以进行化学修饰，而唾液酸的生物合成前体ManNAc（N-乙酰-D-甘露糖胺）的N-Acetyl类似物也可通过代谢途径转化为相应的唾液酸表达在细胞表面。这些修饰基团包括正交反应基团以及光交联基团等，其中叠氮和端炔为最重要的两个生物正交反应基团。这两个基团可以进行点击化学、Staudinger Ligation等生物正交反应，从而偶联上一系列探针。含有diazirine（双吖丙啶）等光交联基团的非天然糖探针最近也被发展出来用于捕获蛋白与唾液酸之间的相互作用。但是这种仅含有一个基团的非天然糖无法实现糖与糖结合蛋白之间相互作用的高通量、实时的捕捉，也无法实现高通量无偏差地分离鉴定糖结合蛋白的问题。

基于在唾液酸N-Acetyl（N-乙酰基）上和9号位上均有成功修饰的非天然糖探针，可以在这两个位置同时引入不同的基团，如在这两个位置同时引入两个不同的生物正交反应基团，就可以通过生物正交反应引入两个具有不同颜色的荧光分子，用于双色成像；还可以分别引入一个生物正交反应基团和一个光交联基团，同时进行成像和富集提纯。这些双功能修饰在研究聚糖－聚糖、聚糖－蛋白相互作用中有重要的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种式I所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaDAz）

所述式I的非天然双功能糖可以通过下述方法制备：

步骤一在避光的反应容器中加入N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（SiaDAz）和甲醇，然后向其中加入三氟乙酸使其反应，反应完成后浓缩、洗涤、分离，制得式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz），结构式如下：

步骤二冰浴及惰性气体保护下，将步骤一制备的式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz）溶于干燥吡啶，搅拌，然后向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaDAz）：

步骤三将步骤二制得的Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaDAz）与叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，经浓缩、分离即得所述式I的9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaDAz）。

其中，上述方法中，所有的反应步骤均需在避光的条件下进行。步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

本发明还提供一种式Ⅱ所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）

所述式Ⅱ的非天然双功能糖通过下述方法制备：

步骤一在反应容器中加入N-(4-炔基)戊酰神经氨酸（SiaNAl）、甲醇和三氟乙酸，搅拌，浓缩，制得式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaNAl）

步骤二冰浴及惰性气体保护下将步骤一制得的式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz）溶于干燥吡啶，搅拌，向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaNAl）

步骤三将步骤二制得的式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaNAl）和叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，浓缩、分离即得所述式Ⅱ的9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）。

其中，上述方法中，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。