[发明专利]非天然双功能糖及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种式I所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸

2.一种权利要求1所述的非天然双功能糖的制备方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一在避光的反应容器中加入N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸和甲醇，然后向其中加入三氟乙酸使其反应，反应完成后浓缩、洗涤、分离，制得式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤二冰浴及惰性气体保护下，将步骤一制备的式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯溶于干燥吡啶，搅拌，然后向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤三将步骤二制得的式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯与叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，经浓缩、分离即得所述式I的9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所有的反应步骤均需在避光的条件下进行。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

5.一种式Ⅱ所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸

6.一种权利要求5所述的非天然双功能糖的制备方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一在反应容器中加入N-(4-炔基)戊酰神经氨酸、甲醇和三氟乙酸，搅拌，浓缩，制得式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤二冰浴及惰性气体保护下将步骤一制得的式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）溶于干燥吡啶，搅拌，向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤三将步骤二制得的式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯和叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，浓缩、分离即得所述式Ⅱ的9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

8.权利要求1和/或5所述的非天然双功能糖作为探针在细胞标记中的应用。

9.一种应用权利要求1所述的非天然双功能糖实现对糖的结合蛋白捕捉的方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一采用含有权利要求1所述的非天然双功能糖的培养基培养细胞；

步骤二通过UV光照，实现对细胞内和细胞膜上与唾液酸相互作用的蛋白质的光交联；

步骤三应用唾液酸苷酶从唾液酸上切掉细胞裂解液中唾液酸修饰的蛋白质；

步骤四通过非天然双功能糖的生物正交反应，使非天然唾液酸上叠氮与带有炔基的生物素反应，生物素则与亲和素结合，实现对与糖相互作用蛋白质的捕捉；

步骤五通过胶内酶切和液相色谱-二级质谱鉴定捕捉的蛋白。

10.一种应用权利要求5所述的非天然双功能糖实现双色成像，其特征在于，包含步骤：

步骤一采用含有权利要求5所述的非天然双功能糖的培养基培养细胞；

步骤二将洗净的细胞与DBCO-Alexa Fluor488进行标记反应；

步骤三用TECP溶液淬灭细胞上未反应叠氮基团；

步骤四向细胞加入预混叠氮荧光647探针的PBS反应液进行荧光标记；

步骤五共聚焦荧光显微镜成像。