[发明专利]一种农杆菌介导培育转基因大豆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导培育转基因大豆的方法。

背景技术

与传统的育种技术相比，转基因育种技术的周期短、效率高、目的性强，是改良作物农艺性状的有效途径。目前，大豆转基因方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法，其中常用的是农杆菌介导法，该方法能够较完整地将T-DNA以单拷贝或低拷贝形式插入植物基因组中。虽然近几年来，农杆菌介导法转化大豆的技术已不断完善，但多数方法需经过外植体的脱分化和再分化的过程，且存在转化效率低、遗传稳定性差、转化周期长等问题。这些问题严重阻碍了功能基因的验证及转基因育种的进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育转基因大豆的方法，该方法通过农杆菌介导将目的DNA转入大豆细胞，包括如下步骤：

1）在大豆种子萌发幼苗的子叶节分生组织处注射含有目的DNA的重组农杆菌的悬浮液后，将所述幼苗进行共培养；

2）将经步骤1）共培养的所述幼苗直接进行长苗培养，即得到具有根、茎和叶的转基因大豆植株；

所述共培养的目的是使所述目的DNA整合到大豆基因组中。

在上述方法中，所述注射时的所述幼苗为种子萌发5—10天（如5、7或10天）的幼苗。

在上述方法中，由于所述幼苗上的顶芽和侧芽会发育成新的组织，为了避免未转基因组织的产生，使整个植株保持一致的转基因特性，在所述注射前，还可包括将所述幼苗的顶芽和侧芽去除的步骤。

在上述方法中，所述重组农杆菌的悬浮液按照包括如下步骤的方法制备：将所述重组农杆菌悬浮于具有如下组成的液体培养基中形成所述重组农杆菌的悬浮液：溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为：1/10的B5基本培养基无机盐成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6-苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400-1000mg/L（如400、700、或1000mg/L）、二硫苏糖醇154mg/L、硫代硫酸钠158mg/L、乙酰丁香酮0-300μmol/L（或为50—300μmol/L、100—300μmol/L、150—300μmol/L或200—300μmol/L、具体可为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、或300μmol/L）、赤霉素0.1mg/L；

所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KNO₃250mg/L、CaCl₂113mg/L、MgSO₄122mg/L、(NH₄)₂SO₄13.4mg/L、KI0.075mg/L、H₃BO₄0.3mg/L、MnSO₄7mg/L、ZnSO₄1.15mg/L、Na₂MoO₄0.21mg/L、CoCl₂0.014mg/L、CuSO₄0.016mg/L、Na₂-EDTA3.73mg/L、FeSO₄15.2mg/L；

所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、盐酸硫铵10mg/L。

在上述方法中，与所述液体培养基相比，所述重组农杆菌的悬浮液的OD₆₀₀值为0.4—1.0（如0.4、0.6、1.0）；所述重组农杆菌的悬浮液的注射量为每个所述幼苗20—100μL(如20、80、100μL)。

在上述方法中，所述注射通过内径为0.06mm-1mm(如0.06、0.1或1mm)、外径为0.2mm-1.14mm（如0.2、0.24、1.14mm）的针头实现。

在上述方法中，所述农杆菌为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。

在上述方法中，所述共培养的条件为在温度25℃、黑暗条件下用水培养3天。