[发明专利]一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及香蕉体细胞再生方法，尤其指一种通过提高胚性愈伤诱导成功率，获得胚性悬浮细胞，由胚性悬浮细胞生成香蕉幼苗的方法。

背景技术

在我国香蕉种植过程中，经常会遇到枯萎病、冻害、台风、采后腐烂等问题。培育多抗高产的新品种是解决这些问题的根本途径。但是现在生产上推广的绝大多数栽培香蕉是三倍体。它们单性结实并且雌性高度不育。常规的杂交育种方法在香蕉上运用起来难度很大。非常规育种方法，例如转基因，是解决香蕉育种难题的一个途径。但是如果像其它植物转基因那样，直接把外植体或者愈伤组织作为转化对象，转化后常会因为嵌合体和胚性愈伤所占比例低而导致得到转基因植株的难度非常大。如果能够得到单个的胚性细胞，把单个的胚性细胞作为转化对象，则这些问题都可以得到解决。理论上来说，胚性悬浮细胞系里边的细胞是各自分离的。它们与农杆菌或银弹接触的概率很高。转基因成功的几率得到提高。每一个胚性细胞能够形成一个植株。将来长成的每一个植株也都来自于一个单独的胚性细胞。转基因后得到的植株将不存在嵌合体的问题。建立一个稳定均一的胚性悬浮细胞系是进行香蕉转基因工作的前提。诱导胚性愈伤是建立胚性悬浮细胞系的第一步。但是从已经发表的文章来看，由香蕉未成熟雄花诱导出愈伤的几率比较低，而且这些诱导出的愈伤中只有很小一部分是胚性愈伤，雄花和愈伤容易褐化坏死，香蕉胚性愈伤诱导成功的几率非常低，只有5％-8％。这意味着诱导香蕉胚性愈伤需要大量的时间和精力。在香蕉未成熟雄花中，位于第十六排到第八排的雄花最适宜于进行胚性愈伤诱导(最靠近尖端分生组织突起的雄花为第一排)。第一排到第八排的雄花在诱导培养基上进行培养的过程中，很容易褐化坏死。然而从理论上来说，未成熟雄花中的细胞是已经高度分化的细胞。得到胚性愈伤组织需要让它们回到早期的胚性状态。那些越接近尖端分生组织突起的雄花距离早期的胚性状态就越近，就越容易被诱导得到胚性愈伤组织。如果未成熟雄花褐化的问题能够被解决，将很有可能会大幅度提高获得胚性愈伤和胚性悬浮细胞系的概率，节约人力和物力。所以，提高获得香蕉胚性愈伤和胚性悬浮细胞系的概率有两条可能途径：一，降低愈伤和未成熟雄花在培养过程中的褐化问题；二，提高诱导出的愈伤向胚性愈伤转化的比例。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供一种大幅度提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法，其能够使花蕾中第一排到第八排的未成熟雄花在胚性愈伤诱导过程中褐化坏死的比例大幅度降低，并且能够使多数未成熟雄花成功诱导出胚性愈伤，进而大幅提高胚性悬浮细胞系成功建立的几率。

为此，本发明的技术方案包括如下步骤：

A、选用目前生产上大面积推广的、胚性悬浮细胞系较难建立的三倍体香蕉作为出发材料，包括：巴西蕉、威廉斯B6、海蕉一号、Anaikomban、Matti。

B、胚性愈伤的诱导

(1)选取开花后1到10周的雄花花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

(2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

(3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

(4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生组织突起的雄花为第1排)，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；