[发明专利]一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及一种孔雀石绿的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属于食品安全检测领域。

背景技术：

孔雀石绿(Malachite green，MG，)属于三苯甲烷类化合物，是一种染料类杀菌剂，可用于治疗鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，曾在多个国家和地区的水产养殖疾病防治中得到广泛使用。然而，MG进入鱼体后会引起鱼类的腮和皮肤上皮细胞轻度炎症。其在水生生物体内的主要代谢产物为隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG，)。近年来，MG及LMG高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用逐渐暴露，人类长期食用有MG残留的水产品，容易造成亚慢性或慢性中毒。因而，20世纪90年代以来，许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。根据欧盟法案2002/675/EC规定，动物源性食品中MG和LMG残留总量限制为2μg/kg；日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出MG残留。我国在农业行业标将MG列为禁用药物。但因其抗菌效果好、价格便宜，仍有个别养殖户在违规使用。我国水产品和环境中MG及LMG残留超标现象常有发生，如欧盟、日本、香港等国家和地区均曾从我国大陆进口的鳗鱼中检出其残留，这不仅带来了一定的生态环境问题，而且已成为影响我国水产品质量安全和国际市场竞争力的重要因素。因此，对MG及LMG残留的检测与监控尤为重要。

孔雀石绿的检测方法常用的有色谱法、免疫学方法、拉曼光谱法等。

免疫学方法包括酶联免疫吸附分析ELISA和胶体金检测方法。主要是利用孔雀石绿的抗体与样品中抗原相互作用。通过显色反应来检测样本中的孔雀石绿。该方法使用方便，检测灵敏度高。但是由于检测样本复杂，基质较多，检测的假阳性几率很高。并且免疫学方法很难区分孔雀石绿和隐性孔雀石绿。

拉曼散射是一种分子受光子激发而成的非弹性散射现象，其可以用来表征化学物质的分子结构特性，也可以用来鉴定分子中存在的功能基团，实现化学分子的指纹辩识。利用该方法检测孔雀石绿具有无需样品制备、可以无创快速检测。但是拉曼光谱检测需要特殊的设备，目前只有在少数科研报告中出现此方法。尚未大规模实际应用。

色谱学方法是利用色谱将样品中的孔雀石绿或隐性孔雀石绿进行分离和再分配。然后检测。可以进行定量分析，是目前为止应用最广泛的也最被认可的检测方法。我国于2005年和2006年相继制定了两套MG残留量的检测标准(GB/T19857-2005、GB/T20361-2006)，规定采用液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法测定水产品中MG。

对于孔雀石绿的色谱学检测来说，样品采集和前处理是目前分析方法的瓶颈，往往是测定误差的主要来源。因此，样品的前处理技术是目前MG和LMG分析研究的难点和热点之一。一般来讲，样品前处理分提取和净化2个步骤，实验大多采用固相萃取柱对样品提取液中的MG和LMG进行净化【Mitrowska K，等J Chromatogr A，2005，1089(1/2)：187】近年来，应用分子印迹聚合物固相萃取(MISE)分离和纯化MG的方法得到广泛的研究。如2010年，Mart ínez等【Martínez B M J AnalChim Acta，2010，665(1)：47-54.】报道了采用MISE分离和纯化MG的方法，平均回收率可达98％；在本发明中，我们制备孔雀石绿免疫亲和柱利用孔雀石绿特异性抗体对待检样本中的孔雀石绿进行分离和净化。操作简单，净化效率较高。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途

为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将孔雀石绿抗体偶联到蛋白G上，制备出了孔雀石绿-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的孔雀石绿免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化孔雀石绿效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的孔雀石绿。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：

本发明最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。