[发明专利]一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种孔雀石绿的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和抗孔雀石绿抗体。

2.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G通过化学键偶联在载体上，孔雀石绿抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。

3.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G是基因重组表达的蛋白G。

4.根据权利要求2中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBank CAA27638.1序列表达的蛋白G，以及进过序列优化后表达的蛋白G。

5.根据权利要求3中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的序列优化的蛋白G，包括针对大肠杆菌表达进行的蛋白G密码子进行优化、对蛋白G进行抗体结合区域进行序列改变以增加亲和力以及增加蛋白G基因序列中抗体结合区域数量以提高抗体亲和能力。

6.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶。

7.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素。

8.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的抗孔雀石绿抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。

9.一种纯化孔雀石绿的免疫亲和柱制备方法，其特征在于

1)琼脂糖sepharose4B，加入0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，，在25℃下摇床反应8小时进行活化。或者购买溴化氰活化的sepharose4B。

2)每克活化的sepharose4B加入30-200nmol的蛋白G，在0.1M NaHCO3，0.5M NaCl PH8.8的缓冲液中，室温偶联2小时。或者4℃偶联过夜。

3)偶联产物用1M Tris.HCl PH8.0室温反应2小时。

4)偶连好的sepharose-蛋白G，用20mM PH7.4的PBS洗涤。

5)将孔雀石绿抗体溶解在同样的20mM PH7.4的PBS中，每克蛋白G-sepharose加入200nmol-1.2umol抗体。室温反应30分钟。

6)将孔雀石绿抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM PBS PH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室温反应1小时。

7)用20mM PH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mMPBS PH7.4洗涤孔雀石绿抗体-蛋白G-sepharose载体。装柱，放于4℃保存。

10.根据权利要求1所述的免疫亲和柱检测孔雀石绿的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：包含但不限于粮食、水产、食品中孔雀石绿的分离纯化。