[发明专利]一种含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质的创制方法

说明书

技术领域

本发明属于作物基因工程领域，具体地说，是涉及含有达玛烷型人参皂苷的水稻的创制方法。 

背景技术

水稻是世界主要粮食作物之一，世界上有近一半的人口以稻米为主食。传统育种技术为改良水稻品质做出了极大贡献，但由于其难以克服物种间生殖隔离的障碍，导致水稻品质尤其是稻米的保健品质难以得到显著的改善。现代基因工程技术的迅猛发展，为水稻品质的遗传改良提供了一种有效手段，即通过基因工程手段可将新的代谢物合成支路导入水稻中，使水稻合成新的功能成分，从而提高水稻的营养保健价值。

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）是五加科（Araliaceae）人参属（Panax）植物，是传统的名贵中药材之一，其核心活性成分是人参皂苷，人参属的所有植物均具有较高的药用价值，如：适应原样作用、增强免疫力、抗肿瘤、抗动脉硬化、保护心肌作用等（张树臣，1992）。人参根的总皂苷含量为2~7%，而竹节人参（P. japonicus）根中的总皂苷含量高达15%以上，约为前者的2~7倍、西洋参的3倍，是总皂苷含量最高的人参属植物（邵春杰等，1983）。人参皂苷属于植物类异戊二烯代谢途径三萜类合成代谢支路的产物——三萜皂苷，2,3-环氧角鲨烯环化酶（2,3-oxidosqualene cyclases, OSCs）是三萜皂苷生物合成的限速酶（高锦明，2003；Haralampidis K.等，2002）。

水稻中的甾醇类化合物与人参属中的三萜皂苷，生物合成的前体均为2,3-环氧角鲨烯，但人参中的OSCs主要包含达玛烯二醇合成酶（dammarenediol-Ⅱ synthase, DS）和β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase, βAS），它们分别催化2,3-环氧角鲨烯合成达玛烷型四环三萜类和β-香树脂烷型（即齐墩果烷型）五环三萜类的前体——达玛烯二醇和β-香树脂醇；而水稻中的OSCs主要是环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase, CS），它催化2,3-环氧角鲨烯合成植物甾醇的前体——环阿屯醇。由此可见，水稻和人参中OSCs基因及其编码的酶的差异导致了2,3-环氧角鲨烯合成不同的产物。

至今人参皂苷尚未能人工合成。人参是多年生草本植物，其栽培和生长条件特殊，对土壤和气候非常敏感，从而难以大规模地推广应用（张树臣，1992；李方元，2002）。

因此，利用基因工程技术克隆获得人参皂苷生物合成途径的关键酶基因，并转化到水稻中，使主食水稻能合成人参皂苷，既可培育“人参稻”良种，又可拓展人参皂苷的来源，具有十分重要的意义和广阔的应用前景。

在对现有文献的分析中，Tansakul等（2006）和Han等（2006）报道从人参中克隆了达玛烯二醇合成酶基因；郭明殊（2010）报道将人参β-香树脂醇合成酶基因转化到水稻中。但至今尚未有将人参属达玛烯二醇合成酶基因转化到水稻中，并创制出含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质的文献报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质的创制方法。

本发明所提供的技术方案为：

一种含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质的创制方法，其特征在于其步骤如下：

1） 将控制达玛烷型人参皂苷生物合成的关键酶即达玛烯二醇合成酶（DS） 基因的全长cDNA，其序列如SEQ ID No.1所示 ，构建到双T-DNA植物表达载体上，获得重组植物表达载体pCDMAR-DS-hpt；

2） 采用农杆菌介导法，将重组植物表达载体pCDMAR-DS-hpt转化到水稻中，经筛选培育后得到含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质。

步骤1）具体的为：从人参属植物中克隆出控制达玛烷型人参皂苷生物合成的关键酶DS基因的全长cDNA，其序列如SEQ ID No.1所示；设计合成DS基因编码序列两端的特异引物，通过PCR扩增，获得DS基因的编码区；将该编码区构建到双T-DNA植物表达载体上，获得含有DS基因编码序列的重组植物表达载体pCDMAR-DS-hpt；

所述的克隆控制达玛烷型人参皂苷生物合成的关键酶DS基因的全长cDNA，具体为：从竹节人参 中克隆出控制达玛烷型人参皂苷生物合成的关键酶DS基因的全长cDNA，其序列如 SEQ ID No.1所示，命名为PjDS。