[发明专利]新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和药物制剂领域，涉及新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法。具体涉及新型阳离子接枝共聚物PCL-g-LPEI的合成；本发明还涉及构建PCL-g-LPEI/DNA复合物和载透明质酸(HA)多重基因复合物的制备方法，作为低毒高效基因载体在基因治疗中应用。 

背景技术

近年来，新型基因治疗方法为癌症治疗、遗传疾病等提供良好的发展前景。研制安全有效、细胞毒性低和肿瘤靶向性非病毒基因传递系统，将成为基因治疗成功的重要因素。基因载体是目前基因治疗的关键难点，主要包括病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体转染效率较高，但存在免疫原性、致瘤性、细胞毒性，制备复杂，对外源基因容量有限(Collin SA，Guinn BA，Harrison PT，et al.Viral vectors in cancer immunotherapy：which vector for which strategy.Current Gene Therapy.2008，8：66-78.)等自身难以克服的隐患，临床应用受到限制。非病毒基因载体转染效率较病毒载体低，但易于制备生产，无免疫原性，无传染性，载基因容量大，具有良好生物相容性(Schatzlein AG.Non-viral vectors in cancer gene therapy：principles and progress.Anti-Cancer Drugs.2001，12：275-304.)，已成为基因治疗领域的研究热点。 

聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是迄今为止研究得最为广泛的阳离子聚合物非病毒基因载体。PEI易于逃离内涵体，在体内外均有较高的转染效率，但细胞毒性大，不能应用于临床。有研究报道PEI的转染效率随分子量的增加而提高(Kunath K，Harpe A，Fischer D，et al.Low-molecular-weight polyethylenimine as a non-viral vectors for DNA delivery：comparison of physicochemical properties，transfection efficiency and in vivo distribution with high-molecular-weight polyethylenimine.Journal of Controlled Release.2003，89：113-125.)，细胞毒性也随之增大。PEI的细胞毒性，主要是由其正电性对细胞膜具有较好的亲和力所致，也是其携载基因进入细胞的作用原理。如何改造阳离子聚合物PEI，降低细胞毒性、提高转染效率成为基因载体研究亟待解决的问题。 

治疗基因成功进入靶细胞进行表达，需要克服一系列生理障碍：血液循环稳定性，细胞膜，内涵体，胞浆传递以及细胞核膜。带大量正电荷PEI与基因形成带正电的复合体，内吞进入细胞形成内含体，通过质子海绵效应成功从内含体逃逸，进入细胞质。苏靖采用酰胺键交联小分子量PEI衍生物作为基因载体，细胞毒性降低，转染效率提高，在多种细胞中具有 较好的生物活性，但形成的PEI-基因复合物多带有正电荷，易与血液中带负电分子如血清蛋白等凝聚，甚至引起补体活化和血细胞凝固(中国专利，申请号：201110327084.6.)。PEG通过共价键或离子键修饰PEI，可提高生物相容性，遮蔽表面正电荷，降低与血清蛋白等物质的结合，延长体内循环时间(中国专利，申请号：200880023048.7.)，但形成基因复合物稳定性差，粒径过大，不易被细胞摄取。采用疏水性材料修饰PEI，可改善基因复合物的稳定性，降低粒子平均粒径。将超支化PEI与疏水性聚(γ-苯甲基L-谷氨酸盐)片段(PBLG)反应生成水溶性PP，可有效包载pDNA，避免核酸酶的降解，形成平均粒径为96nm的纳米粒，细胞毒性降低，且在HeLa细胞、Vero细胞和293T细胞的体外转染效率明显高于PEI(Tiana H，Xiong W，Wei J，et al.Gene transfection of hyperbranched PEI grafted by hydrophobic amino acid segment PBLG.Biomaterials.2007，28：2899-2907.)。