[发明专利]新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用

权利要求书

1.一种新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体，其特征是，该阳离子接枝共聚物通过开环共聚合成端基为羧基的聚己内酯，利用酰胺化反应接枝到L聚乙烯亚胺上，合成阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺；所述多重复合非病毒基因载体的组成包括：(A)载质粒DNA的聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺阳离子复合物作为多重基因复合物的内核；(B)肿瘤靶向配体透明质酸通过正负电荷相互作用包裹阳离子复合物，作为多重基因复合物的外壳；阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-线性聚乙烯亚胺的结构式为： 

阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体组装多重基因复合物示意图如图1； 

其中，L聚乙烯亚胺为线性结构，分子量为10000～25000Da；聚己内酯分子量为1000～4500Da，透明质酸分子量为4000～45000Da；通过控制聚合反应的单体投料比，聚合反应时间以及聚合反应温度，控制聚己内酯的分子量和接枝率；按照质量计算：聚己内酯与L聚乙烯亚胺的比例为1∶2.5～1∶40，接枝率为5～35％； 

阳离子复合物中聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺与质粒DNA的N/P(即氨基氮摩尔数/DNA的PO₃^-摩尔数)比为10～40∶1；多重基因复合物中透明质酸与聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的COO^-/N(透明质酸的羧基摩尔数/聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的氨基氮摩尔数)比为1～12∶1。 

2.根据权利要求1所述新型阳离子接枝共聚物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 

(1)以纯化水为引发剂，将ε-己内酯和纯化水加入三口瓶，加催化剂Sn(Oct)₂，120℃反应2～4h，冷却至室温，加入氯仿溶解，加甲醇沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥4h，即得聚己内酯； 

(2)将聚己内酯加入三口瓶，加N，N’-二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，加二甲亚砜溶解，氮气保护25℃反应12h，加L聚乙烯亚胺，搅拌溶解，80℃反应48h，过滤，置透析袋在去离子水中透析72h，透析袋截止分子量8000，冷冻干燥，即得聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺。 

3.根据权利要求1～2所述的新型阳离子接枝聚合物及多重复合非病毒基因载体的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)称取聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺溶于纯化水中，超声溶解，探针超声10min，过滤除菌，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；取质粒DNA适量，配制成0.2μg/μL DNA水溶液，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；按照选定N/P比，将聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺溶液滴加至DNA水溶液，涡旋30s，37℃孵育0.5h，即得阳离子基因复合物； 

(2)取透明质酸适量，加纯化水溶解，用0.22μm Milipore膜过滤除菌，按照选定的COO^-/N比，将透明质酸溶液缓慢滴加至阳离子基因复合物中，混匀，37℃继续孵育0.5h，得多重基因复合物。 

4.根据权利要求1～3所述的多重复合基因载体和多重基因复合物，其特征是，所述多重基因复合物，其中核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列，包括报告基因和治疗基因两种，所述报告基因是绿色荧光蛋白质粒DNA选自EGFP-C1、EGFP-C2、EGFP-C3，EGFP-N1，虫荧光素酶质粒DNA选自pGL3、pGL4，优选PGL4.74，；治疗基因选自血管内皮生长因子、p53、干扰素、肿瘤坏死因子、白介素-12、白介素-2及其组合；多重基因复合物的平均粒径为20～350nm。 

5.根据权利要求4所述的多重复合基因复合物，其特征是，体外转染细胞方法，包括使细胞与多重复合基因复合物接触，在允许多重基因复合物进入细胞及DNA在细胞中表达的条件下培养细胞。 

6.根据权利要求1～5所述多重复合基因载体的应用，其特征在于，多重复合物或复合物可用于体外细胞递送DNA的用途，更重要作为肿瘤靶向非病毒基因载体，在生物技术、药物制剂领域具有潜在治疗肿瘤的应用。 

7.根据权利要求1所述阳离子接枝共聚物及多重复合基因复合物，其特征在于，所述多重复合物在临床给药剂型为纳米粒、胶束，给药方式为静脉注射、黏膜给药。