[发明专利]一种基于分子马达、磁富集和双探针杂交技术的生物传感器构建及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物大分子的检测方法。尤其涉及利用ATP分子马达、双探针杂交、磁富集和分离以及化学发光检测技术高灵敏性地检测生物大分子的方法。 

背景技术

生物传感器是利用生物要素与物理化学检测要素组合在一起对被分析物进行检测的装置。双抗体夹心法是传统生物大分子检测方法的一种，其基本原理是利用一对可以识别同一分子不同表位的特异探针(抗体或者核酸)，通过不同的信号输出系统进行检测。对于蛋白类的大分子检测，常用的方法为基于抗原抗体结合的酶联免疫吸附实验，对于核酸类大分子(包括DNA，RNA，microRNA等)，常用northern blot，southern blot，PCR等技术。常用的信号输出系统包括荧光、化学发光、同位素以及分子的聚集状态等。也有一些新的检测方法，如依赖量子点，纳米金颗粒作为检测信号进行检测。但这些信号输出系统均为瞬时信号输出，信号分子与反应体系无法分离，并且检测信号必须在反应之后立即检测，无法对同一样的信号本进行多次检测，因此其检测灵敏度受到限制，且不利于不同时间样本间的比较。 

发明内容

为了提高蛋白质、核酸等生物大分子检测的灵敏度、特异性和缩短检测时间，避免核酸扩增，降低假阳性率，降低检测费用，实现高通量检测，本发明提供一种可在空间上和时间上放大检测信号的生物大分子检测方法。该方法将分子马达与磁分离技术和双探针杂交技术相结合，在液相环境中进行检测，不仅可以快速检测出微量的目标生物分子，还可以区分目标分子与杂蛋白或单点突变的核酸分子。并在一定范围内可对目的分子进 行定量分析，提高了检测的灵敏度，特异性，以及便于进行高通量检测。 

本发明设计了针对靶分子的两个特异性探针。对于抗原，探针为针对同一抗原不同表位的特异抗体；针对DNA分子，探针为与正义链序列的5’端和3’端分别互补的一对核酸探针；对于RNA序列，探针为与RNA序列5’端和3’端分别互补的一对核酸探针。将其中一个探针作为捕获探针连接到磁珠上，将另一个探针作为检测探针连接到ATP分子马达上，通过优化的杂交条件进行杂交，将结合有分子马达的磁珠通过磁分离技术与未结合的游离分子马达分离，经过在高温下进行ATP合成反应，将合成的ATP经过磁分离与反应体系分离，此时的ATP作为信号分子可以分装冻存于-80℃保存，选择合适的时间进行测量，也可直接通过荧光素/荧光素酶系统检测ATP的浓度来反映靶分子的存在状态。若存在靶分子，则会有分子马达活性存在，经过空间上的信号磁富集以及时间上的合成ATP信号放大，可检测到低浓度的靶分子。对于核酸，避免了扩增带来的假阳性以及复杂的操作过程和昂贵的仪器设备。ATP分子与反应体系的可分离以及可保存，使同一样本的检测信号可以在不同时间进行检测，并且可以将不同批次的样本检测信号同时进行测定以利于样本间的比较。本发明将连接有捕获探针的磁性微球和连接有检测探针的ATP分子马达作为敏感生物元件捕获靶分子，ATP分子马达和荧光素/荧光素酶系统作为换能装置，将靶分子浓度信号转换成ATP分子浓度信号和化学发光信号，最后通过化学发光光强度作为检测信号来反应靶分子浓度。本发明在空间上通过二次换能(靶分子浓度-ATP浓度-化学发光强度)放大检测信号的基础上，增加了时间累积放大效应(相同浓度靶分子产生的ATP合成反应，随时间延长合成ATP浓度增加)，并且通过双探针的高特异性，降低了非特异分子的干扰。通过磁分离技术实现了将信号分子与反应体系分离，将同一样本的信号在不同时间分次测定以及不同样本的信号同时测定进行比较。 

更具体地，本发明提供以下各项： 

1.一种检测生物大分子的方法，所述方法包括以下步骤： 

a.将捕获探针与磁珠连接； 

b.将检测探针与ATP分子马达连接； 

c.将通过步骤a得到的连接有捕获探针的磁珠和通过步骤b得到的连 接有检测探针的ATP分子马达与待测生物样品混合杂交； 

d.在步骤c后对磁珠进行磁分离，将分离的磁珠加入到含有ADP的反应混合液中进行ATP合成反应；以及 

e.在ATP合成反应结束后，取不含磁珠的反应上清在化学发光仪上进行读数； 

其中所述捕获探针和所述检测探针分别与所检测的生物大分子的不同部位特异性结合。 

2.根据第1项所述的方法，其中所述生物大分子是蛋白质，并且所述捕获探针和所述检测探针分别是针对所述蛋白质的两个不同表位的特异性抗体。