[发明专利]用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及反应检测体系。

背景技术

布鲁杆菌病是由布鲁杆菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。布鲁杆菌病的防控和治疗关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。目前用于常规的布鲁杆菌诊断技术有细菌分离培养、血清凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、PCR等方法，但上述方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在基层生产中普及应用，因此建立一种简单、快速、准确的病原诊断方法显得十分必要。

Notomi等于2000年发明了环介导等温核酸扩增（LAMP）技术，该技术依赖4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列（Notomi T,Okayama H,MAsubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种方法操作简便，实验仪器要求较低的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物，包含扩增布鲁杆菌保守基因omp25特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，序列如下：

外引物：F3     5’-ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’

B3     5’-GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’

内引物：FIP    5’-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’

BIP    5’-GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’

所述引物与基因omp25的412-618bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

采用上述的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物的检测反应体系，25μL反应体系为：

外引物F3：5pmol·L^-1、0.5μL

外引物B3：5pmol·L^-1、0.5μL

内引物FIP：40pmol·L^-1、0.5μL

内引物BIP：40pmol·L^-1、0.5μL

Mg²⁺：100mM、2μL

甜菜碱：5M、4μL

dNTP混合液：10mM、3.5μL

不含Mg²⁺的10×buffer：2.5μL

Bst DNA聚合酶：8U·μL^-1、1μL

模板：2μL

去离子水：8μL

反应温度为63℃。

本发明的有益效果是：本发明针对布鲁杆菌的OMP25基因设计了一套LAMP特异性引物，建立了一种用于布鲁杆菌基因检测的方法。与传统PCR相比，该方法操作简便，实验仪器要求较低，在普通恒温水浴锅中反应45min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定布鲁杆菌，在基层生产中具有广阔的推广应用前景。

附图说明

图1是布鲁杆菌LAMP产物电泳图（M.100bp DNA ladder marker（100bp梯状DNA分子量标准）；1.布鲁杆菌LAMP扩增产物；2.阴性对照）。

图2是敏感性试验结果（M.100bp DNA ladder marker；1～7.布鲁杆菌DNA稀释液浓度分别为5×10⁵～5×10^-1copies/μL；8.阴性对照）。

图3是特异性试验结果（M.DNA标准DL2000；1.羊种布鲁杆菌；2.胎儿弯曲杆菌；3.大肠杆菌；4.沙门氏菌；5.犬种布鲁杆菌；6.金黄色葡萄球菌；7.猪种布鲁杆菌；8.牛种布鲁杆菌；9.阴性对照）。

图4是本发明布鲁杆菌OMP25基因引物设计位点。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：