[发明专利]全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法

说明书

技术领域

本发明属于长节段外周神经损伤修复技术领域，涉及一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法。

背景技术

周围神经损伤，尤其是长节段的周围神经缺损的修复以及功能重建一直是再生医学领域研究的重大课题。

虽然周围神经具有再生的能力，但这种再生能力的效能较低，容易被周围的疤痕所阻挡，从而使再生轴突分散，最终形成神经瘤。当前，自体神经移植被认为是治疗周围神经损伤或病灶切除后造成缺损的最有效的方法。然而，这种组织移植方法往往伴有供区新的创伤、免疫排斥反应或受到供区或供体其他许多条件的限制，以至于不能达到理想的修复效果。因此，人工组织工程神经支架则成为了解决这一问题的重要手段之一。

众所周知，组织工程支架、种子细胞和生长因子（或生物反应器）是组织工程的三大要素。其中，组织工程支架和种子细胞是其中最重要的两个因素。将功能性种子细胞接种到支架中修复组织缺损，往往能达到类似于自体组织移植的良好修复效果。因此，功能性的接种有种子细胞的神经支架具有非常可观的临床应用前景。然而，随着研究的进一步深入，学者们发现当组织的体积达到数立方毫米时，其内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持。如何才能够保证接种到神经组织工程支架中的功能性细胞既能够大量、均匀的分布，又能够保持良好的活性和功能状态，成为了目前一个急需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，解决了现有神经导管联合种子细胞修复长节段神经缺损时出现的早期氧供不足的问题。

本发明所采用的技术方案是，全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；

步骤2、采用京尼平和乙醇混合溶液对经步骤1制得的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行交联及消毒处理；

步骤3、种子细胞的培养与纯化；

步骤4、制备无菌的全氟三乙胺乳液；

步骤5、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液与经步骤3得到的种子细胞混合，并用双筒等量注射器注射到步骤2得到的消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。

本发明的特点还在于，

步骤1具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为1～8:1；

步骤1.2、将经步骤1.1称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；

步骤1.3、将经步骤1.2.4配制的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液倒入神经导管成形模具中，进行注模和冷淋固形处理；

步骤1.4、制备出多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。

步骤1.2具体按照以下步骤实施：

步骤1.2.1、配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；

步骤1.2.2、按步骤1.1中称取的I型胶原蛋白的质量取冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经22h～26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；

按步骤1.1中称取的壳聚糖的质量取步骤1.2.1中配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的冰醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h～26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；

步骤1.2.3、将经步骤1.2.2得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2℃～6℃条件下，恒温搅拌处理70min～110min，得到混合悬浊液；

步骤1.2.4、将经步骤1.2.3得到的混合悬浊液先进行抽真空处理，之后再静置10h～14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。

步骤1.3具体按照以下步骤实施：

步骤1.3.1、将经步骤1.2.4得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；

步骤1.3.2、在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2×10^-3m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h；