[发明专利]分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物的分子鉴定领域；尤其涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。

背景技术

结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1/3有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。而非结核分枝杆菌（Non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染在我国总体也呈上升趋势，1984/1985年第二次全国结核病流行病学调查(简称流调)NTM发病率为4.2%，1990年第三次流调为4.9%，2000年第四次流调则增至11.1%，而在2010年第五次流调中则上升为22.9%。然而这个比率远低于欧洲和美国的发病率（＞40%）。按照流行病学的理论，随着国家结核病防治规划效果的日益显现，NTM在结核病总体发病中所占的比率逐步提高。因此，预计我国未来NTM的发病率仍有上升空间，所以对NTM的研究也应该提高重视程度。

NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。而临床对于感染了结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的患者治疗方案完全不同：非结核分枝杆菌多数对常用的抗结核药物天然耐药（NTM耐多药率高达83.7%），但一些广谱的抗生素对治疗NTM感染有效，而这些广谱抗生素对结核分枝杆菌感染的抗菌作用很弱，甚至没有作用；常见的能够致病的NTM有30余种，针对不同种NTM治疗的药物选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在NTM感染，是何种NTM感染，对临床治疗具有重要意义。

目前临床上常用的鉴定NTM的方法分为两大类，一类是传统生化的方法，操作繁琐并且不够准确，所以已基本被弃用，仅有含对硝基苯甲酸（PNB）的选择性培养基法仍然广泛使用，用于初步区分结核分枝杆菌复合群（MTC）和NTM；另一类为分子生物学方法，以比较同源基因/序列的序列差异来鉴定NTM至种水平，该方法以操作简单、快速、能够鉴定分枝杆菌至种水平等优势成为目前最常用的方法，并且已经衍生出了各类商业试剂盒(如DNA芯片技术,线形探针杂交技术)应用于临床。目前最见的用于分枝杆菌菌种鉴定的同源基因/序列包括：16srRNA编码基因、16s-23s rRNA间区（ITS）、hsp60和rpoB基因。采用单一的基因或现有基因组合对NTM的鉴别依然仅能鉴定常见致病NTM中的一部分，少量NTM由于种间序列的高度同源性，现有的鉴定技术不能够区分。如鸟分枝杆菌复合群、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌，即使联合使用16s rRNA编码基因和ITS,也不能区分。现有的鉴别技术鉴定为同一种的分枝杆菌，有可能被新的标识鉴定为几种分枝杆菌或分为几个亚种，如经16s rRNA基因和ITS鉴定为脓肿分枝杆菌的菌群，在结合使用hsp60和rpoB基因后，进一步分为了脓肿分枝杆菌、M.massiliense和M.bolletii。目前对分枝杆菌菌种鉴定技术主要关注的是其鉴定NTM至种的能力，实际上通过更多的分子标识的使用，有可能将同一种NTM分为更多的亚型，更细致的分型不仅有助于流行病学研究，而且当与患者的病史结合时，还有可能建立不同亚型与患者发病的联系，由此了解宿主的免疫机制与发病机制，类似的研究在国际上还未被关注过。因此，发现更多的分子标识，提高分枝杆菌菌种鉴定技术的鉴别能力，对临床诊断和治疗具有重要的参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。

本发明第一方面提供了rpsA基因在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。

rpsA基因（作为一种新的分子标识）用于在分枝杆菌菌种鉴定中，通过一种通用引物对，包括正向引物和反向引物，扩增分枝杆菌（Mycobacterium）的rpsA基因，从而鉴定或区分不同的分枝杆菌。优选的，其中所述正向引物为5’-CCCTACATCGGCAAGGAG-3’(SEQ ID No：1)，所述反向引物为5’–TGTCGATGACCTTGACCATC-3’（SEQ ID No：2）。其中，正向引物，位于结核分枝杆菌的rpsA基因的487-504位置，gene bank号为NC_000962.2；反向引物位于结核分枝杆菌的rpsA基因的1032-1051位置，gene bank号为NC_000962.2。