[发明专利]分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用

权利要求书

1.rpsA基因在制备分枝杆菌菌种的分类鉴定试剂盒中的应用，其中所述分枝杆菌菌种包括非结核分枝杆菌菌种，所述rpsA基因为所述分枝杆菌菌种的rpsA基因。

2.权利要求1所述的应用，其中所述rpsA基因通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。

3.权利要求2所述的应用，其中所述正向引物如SEQ ID No：1所示，所述反向引物如SEQ ID No：2所示。

4.通用引物对，其特征在于所述通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌Mycobacterium的rpsA基因，其中所述正向引物如SEQ ID No：1所示，所述反向引物如SEQ ID No：2所示。

5.一种制备分枝杆菌的分类鉴定试剂盒的方法，该方法利用权利要求4所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。

6.权利要求5所述方法，该方法包括如下步骤：

a)以待测菌株的基因组DNA为模板，以正向引物和反向引物进行PCR扩增，对扩增所得DNA片段进行回收、纯化、测序，得rpsA基因序列；

b)根据序列测定结果构建系统发育树，获得鉴定结果。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，

所述步骤b)为：将序列测定结果与GenBank数据库中所有的分枝杆菌的rpsA基因序列进行BLAST比对，构建系统发育树，获得鉴定结果；或者，

所述步骤b)为：利用Clustal X软件对待测菌株的rpsA基因序列进行多序列重排；其间同时加入不同分枝杆菌菌种的标准菌株的rpsA基因序列，利用MEGA软件建立包含多种分枝杆菌标准株的系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。

8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，

步骤a)中PCR扩增的具体操作为：扩增反应体系25μl，正向引物浓度及反向引物浓度分别为20pmol，模板DNA 50ng，Taq酶1U，脱氧核苷三磷酸终浓度250μM，MgCl₂终浓度1.5mM；扩增反应条件为：95℃变性5分钟，之后以95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒为一循环，循环30次，72℃延伸5分钟。

9.一种分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，其特征在于应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术；

其中，所述分枝杆菌菌种包括非结核分枝杆菌菌种，所述rpsA基因为所述分枝杆菌菌种的rpsA基因。

10.按照权利要求9所述的分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，其特征在于包含SEQ ID No：1所示的正向引物和SEQ ID No：2所示的反向引物，还包括dNTPs、10×Buffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。