[发明专利]一种葡萄果实糖分HPLC-ELSD测定方法

说明书

技术领域

本发明属于食品糖分检测技术领域，特别涉及一种葡萄果实糖分HPLC-ELSD测定方法。

背景技术

葡萄是世界上最重要的水果之一。葡萄果实皮薄多汁，酸甜味美，营养丰富。成熟的浆果中含糖量可达10%～30%，葡萄果实的糖分以葡萄糖、果糖为主，此外还含有少量的蔗糖，容易被人体直接吸收；葡萄果实中的多种果酸有助于消化；葡萄果实中含有多种对人体有益的矿物质、维生素、氨基酸、卵磷脂以及美容养颜的花青苷、类黄酮、白藜芦醇等成分。葡萄用途广泛，可用于鲜食、制酒、制汁和制干。葡萄果实糖分含量是影响浆果品质的重要指标。糖分组成及其含量高低不仅直接影响成熟浆果的营养品质和风味；而且作为花色苷合成前体物质，果实糖分组成及其含量会影响葡萄浆果的着色，从而影响鲜食葡萄的外观品质和酿酒葡萄的加工品质。因此，葡萄果实生长发育过程中以及成熟采收时，准确、快速测定葡萄的糖分非常重要。

目前，常用于分离和测定糖组分的方法有气相色谱（GC）法和高效液相色谱（HPLC）法等。但GC法需将试样在柱前衍生成可气化的挥发性成分，操作繁琐、耗时长。H PLC法较气相色谱法简单方便，无需衍生化，并且测定单糖、低聚糖效果较好。HPLC法检测糖类的检测器有示差检测器（RID）、紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器和蒸发光散射检测器（ELSD）等。RID是HPLC法检测糖类的常用检测器，基于连续测定色谱柱流出物折射率的变化；它对温度极其敏感使得基线很不稳定，与梯度洗脱不相容，且检测灵敏度很低。ELSD是基于色谱柱流出物雾化后的不挥发性溶质颗粒的光散射电信号对样品进行定性定量，其响应不依赖于样品的光学特性，不要求样品带有发色团或荧光基团，因而具有稳定性好、灵敏度高、无溶剂峰干扰等优点。传统高效液相色谱法测定糖分时，常用色谱柱中的氨基柱，对乙腈纯度要求高，稳定性差，固定相易流失，寿命短，价格昂贵。ODS柱（十八烷基硅烷键合硅胶填料，也称C18柱）的目标峰分离不完全，效果不理想。Waters高效糖柱、Zorbaxa高效糖柱等均为等度洗脱，一些糖的分离不如梯度洗脱的好，如果梯度洗脱则可能会造成其柱床的化学降解而影响柱效。其它离子型糖柱则必须在高柱温下才能使一些糖成分达到分离。Prevail糖柱作为专用糖柱，为聚苯乙烯-二乙烯基苯键合的氨基糖柱，不存在困扰其它糖柱如氨基柱、高效糖柱、ODS柱以及其他离子型糖柱的问题，没有化学降解现象，分离效果良好，且在室温及梯度洗脱的情况下亦很稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄果实糖分的检测方法，该方法是利用HPLC-ELSD测定方法检测葡萄果实糖分的。

一种葡萄果实糖分HPLC-ELSD测定方法，包括如下步骤：

1）取样

葡萄谢花后20-25d起，在植株的东、西、南、北四个方向及上、中、下三个位置，采取中等大小、无病虫害的果实，每隔7-10d采一次样；果实采后迅速放入冰盒中，带回实验室放入-80℃冰箱中备用；

2）样品处理

分别取大小均匀、色泽一致的洗净晾干的葡萄15～20颗，用榨汁机打碎并混匀，迅速精确称取匀浆1.00g，用90%的乙醇定容到25mL容量瓶中，称重；在常温下，用超声波提取20-40min，取出、室温冷却后，加90%的乙醇补充到之前定容25mL时液体的重量；将提取样品常温下8000-12000r/min离心15-30min，取上清液，经0.25μm滤膜过滤后用作供试样品；

3）标准溶液的配制

分别用超纯水配制浓度为0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL的葡萄糖、果糖和蔗糖的系列浓度标准工作液；进样前经0.25μm滤膜过滤，取滤液进样；

4）色谱条件

色谱柱为聚苯乙烯-二乙烯基苯键合的氨基糖柱Prevail carbohydrate ES（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈和水的混合物，其中，乙腈和水的体积比为70-80:30-20；流动相流速为1mL/min；柱温：30℃-35℃；检测器选用蒸发光散射检测器（ELSD），检测池温度40℃-80℃，进样量10μL；

5）线性相关性和精密度考察

以步骤3）配制的0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL的葡萄糖、果糖、蔗糖的系列标准工作液，按步骤4）所述的色谱条件进样分析并计算，得标准曲线回归方程；