[发明专利]一种降低金线莲组培污染率的方法及其培养基配方

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种降低金线莲组培污染率的方法及其培养基配方。

背景技术

金线莲（Anoectochilus roxburghii）又名金丝草，为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵中药，具有清热凉血、除湿解毒等功效，用于治疗糖尿病、肾炎、膀胱炎等症，在民间享有“药王”的美称。浙南、闽台及两广一带长期用金线莲煮水、泡茶、煲汤，用于强身健体、滋补调养。现代研究表明金线莲中含有多糖、黄酮类、强心苷类等多种成分，可增强人体免疫力，提高机体抵抗力、防止疾病的侵袭，增强并改善体质等功效。

金线莲长期以来依靠采挖收集野生资源，而野生金线莲繁殖率极低，致使资源蕴藏量迅速下降，部分传统产区已无药可采。金线莲种苗是其栽培的关键环节，种苗的优劣直接关系到金线莲的生长发育、产量和品质。由于金线莲种子不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌共生下，才能促使其种子萌发生长，所以生产上主要采用茎段繁育种苗。但是在组培生产过程中由于细菌、真菌等微生物引起的污染问题（污染率一般为20%以上）一直是当前制约金线莲种苗繁育的主要障碍。污染初期会导致增殖效率的降低，培养材料生长延缓；污染后期会导致组培苗移栽困难和死亡，甚至有的会引起培养材料的遗传变异。因此寻找一种降低金线莲组培污染率的方法及其培养基对于提高组培成功率、降低成本、提高经济效益等都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术存在的不足，提供一种降低金线莲组培污染率的方法及其培养基配方的技术方案。

本发明提供的技术方案是：

一种降低金线莲组培污染率的培养基配方，其特征在于所述的培养基配方为1/2MS、香蕉40～60g/L、活性炭0.8～1.2g/L、NAA0.8～1.2mg/L、6-BA0.4～0.8mg/L、蔗糖22～30g/L、琼脂粉5.5～6.5g/L、洋葱40～60g/L、螃蟹壳粉10～20g/L。

所述的一种降低金线莲组培污染率的培养基配方，其特征在于所述的培养基配方为1/2MS、香蕉50g/L、活性炭1.0g/L、NAA1.0mg/L、6-BA0.6mg/L、蔗糖26g/L、琼脂粉6.0g/L、洋葱50g/L、螃蟹壳粉15g/L。

培养基配方降低金线莲组培污染率的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）接种室消毒：每月内用艾叶和雷公藤对接种室薰蒸一次进行灭菌消毒；每周内用臭氧发生器对接种室进行一次灭菌消毒；

2）培养室消毒：每月用艾叶和雷公藤对培养室薰蒸一次进行灭菌消毒；每周用臭氧发生器对培养室进行一次灭菌消毒；

3）培养基配制：以1/2MS为基础培养基，按照配方进行配制，混匀后将培养基的PH值调节至5.8～6.0；将配制好的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热分装于干净的培养瓶中后加盖；

4）培养基和接种器具灭菌：采用高压蒸汽法对培养基和接种器具进行灭菌。

5）外植体接种：

当采用自然生长的金线莲植株作为外植体时，用自来水洗净金线莲，转入70%乙醇漂洗30s，再用0.1%升汞灭菌10min，无菌水反复冲洗5～6次，沥干水分，剪成带1个节茎段，接种于准备好的培养基上；

当采用金线莲组培无菌苗作为外植体时，将金线莲剪成带1个节茎段，接种于准备好的培养基上；

6）组培苗培养：将接种好的培养瓶移入培养室，培养条件：温度24±2℃，光照时间12h/d，光照强度1800～2000lx，培养时间四个月。

所述的培养室应定期打扫，每天喷洒75%的酒精除尘，阴雨天开空调除湿，以保持干净和室内空气干燥；发现培养室有污染的培养瓶应立即灭菌处理，以防扩散。接种前，接种室和超净工作台开紫外灯照射消毒30min，然后打开超净工作台吹风20min，用新洁尔灭擦拭台面后使用；污染的培养瓶须经过高温高压灭菌后方可使用。

所述步骤4）灭菌时要保证灭菌锅内部清洁，内部的冷气排尽，装填的灭菌物不能堆放过满，保持灭菌锅温度在121℃、105kPa、20min；培养基灭菌后，先放入缓冲间，抽取样品放在培养室培养2～3d，若培养基表面和内部均无任何细菌痕迹和真菌菌斑，方可使用；刀、剪、镊子等金属用具在接种前用75%酒精棉球擦拭，再在带有石英砂的消毒器内高温消毒5～10min，冷却后使用。