[发明专利]一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于血浆分离和蛋白质的检测领域，特别涉及一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法。

背景技术

全血是由液态血浆、红细胞、白细胞、血小板等成份组成。在现代医学检测中，由于血细胞或者血红素对光谱分析存在很大的干扰，通常都首先把血浆从血液样品中分离出来，然后用于生化或免疫诊断分析。目前，离心法和过滤法是临床中使用最普遍的方法。离心法是利用惯性离心力和物质沉降系数的原理来达到分离效果，而过滤法是通过滤膜或固体支撑物来实现血浆的分离。但这两种方法都存在一定的不足之处，前者分离设备体积庞大、操作复杂，后者滤膜孔容易被血细胞堵塞导致分离效率降低和样品污染。因此，如何有效地将血浆从全血中分离并与检测有机地结为一体是研究的热点。

近年来，微全分析系统因具有微型化、集成化和智能化的特点而备受研究者关注，尤其是分析速度快、所需样品量为几微升或更低，所以微全分析系统将为生物医学、分析化学提供更好的检测平台。微流控技术是微全分析系统的核心，微芯片尺寸在厘米量级，采用MEMS技术在硅片、玻璃或塑料等基底材料上制造出通道网络、反应混合池、检测器等元器件集一体的多功能芯片。因此，在微芯片上实现微量样品的分离与检测一直是大家关注的焦点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，该微芯片将全血中血浆的分离、检测连接为一体，可以一次针对多个靶目标的检测，具有特异、快速和高灵敏的特点，并且不需要复杂的仪器以及酶反应的实验条件，可望应用于临床中微量全血中多种蛋白的诊断和检测。

本发明的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，包括：

以硅片为基底材料，以SU-8光刻胶作为掩模层，分别曝光、显影制作固定蛋白的模具A和分离检测模具B；将PDMS和固化剂（Sylgard184curing agent）以重量比5～10：1混合后，分别浇注在模具A和模具B上，加热固化；分别剥离模具A上的PDMS结构A-PDMS、模具B上的PDMS结构B-PDMS；A-PDMS打进样孔和出样孔后，与经过处理的玻璃片贴合，用于固定多个抗体；将A-PDMS揭掉后，将固定有抗体的玻璃片与B-PDMS对准贴合，并取另一经打孔的玻璃片贴合在B-PDMS的另一面，构成玻璃-PDMS-玻璃的夹心结构，即得微芯片。

所述A-PDMS的尺寸为100μm高×100μm宽。

所述B-PDMS包括血浆分离管道、细胞沉积管道和废液池，其中血浆分离管道的尺寸为15μm×100μm×23mm，细胞沉积管道的尺寸为100μm×500μm×20mm，废液池的尺寸为100μm×1.6mm×9mm。

所述加热固化的温度为90℃，固化的时间为1小时。

所述经过处理的玻璃片为经过醛基修饰的玻璃片。

所述固定多个抗体的温度为37℃，时间为2小时；其中，多个抗体具体为BSA、CEA、CyFRA21-1和IgG抗体。

所述微量蛋白检测中的微量蛋白为抗原或抗体。

所述得到的微芯片配合纳米金标记抗体应用于全血中血浆的分离和蛋白质的检测；具体步骤包括如下：

纳米金标记单克隆二抗NP与样品混合后，加入微芯片的进样口，通过分离区域时血细胞沉积，同时血浆和NP流入检测区域，与芯片上固定的单克隆一抗形成NP-抗原-一抗夹心结构，从而造成信号放大，通过纳米金显色得出结果。

所述纳米金标记抗体的制备方法包括：

（1）配置浓度为1mM HAuCl₄溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，将HAuCl₄溶液加热至130℃，20分钟时加入25ml柠檬酸三钠溶液，持续搅拌至溶液冷却至室温，即形成为酒红色溶液；以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的13nm纳米金溶液，4℃保存备用；

（2）取500μl的上述纳米金溶液，用碳酸钾调节pH为8.2，加入30μl的二抗，放置1～2个小时后多次加入4μl的0.1M NaCl和0.01M PB，4℃保存。

步骤（2）中的纳米金溶液浓度为12.2nM，二抗的浓度为0.1mg/ml。

本发明微流体芯片（简称微芯片）中微结构的示意图如图2所示。利用标准的光刻工艺实现微结构的制作，用玻璃片与微结构可逆封接制备了所需的微芯片。该微芯片将全血中血浆的分离和蛋白质检测连接为一体。整个芯片大小为75mm×25mm,由分离区域和检测区域两个部分组成。