[发明专利]一种检测尿液中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药及体外诊断试剂领域，具体涉及检测尿液样本中前列腺癌组织表达基因PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒。 

背景技术

前列腺癌(prostate carcinoma，PCa)是男性常见的恶性肿瘤之一，除少数病例外；其生长大多比较缓慢，潜伏期较长，有些甚至终生不被发现。许多患者早期没有任何主观不适，等出现临床症状时已至疾病晚期，从而错过了最佳治疗时机。临床上探寻前列腺癌的早期诊断方法，一直是研究的热点。因此，开发早期诊断前列腺癌的试剂盒有重要的临床价值。目前血清前列腺特异性抗原(PSA)是临床应用最广泛的前列腺肿瘤标记物，PSA敏感度高，但特异度较低，由此导致临床前列腺穿刺活检阴性几率较高，以及多次前列腺重复穿刺活检、过度诊断和过度医疗等问题。因此人们不断寻找敏感性高，特异性强的检测项目。 

PCA3(prostate cancer antigen3)是1999年Bussemakers等应用差异显示分析方法，通过比较前列腺癌组织和正常前列腺组织的mRNA表达谱时发现的一种前列腺癌特异性基因。PCA3基因位于9号染色体长臂2区1带到2带，全长25000bp，含有4个外显子和3个内含子，具有很高的组织特异性和癌特异性，在癌变的前列腺细胞中表达量很高，具有较高的敏感性和特异性，是最新发现的前列腺癌早期诊断筛查和对治疗后的患者进行有效的监测的标记物。Hessels等应用RT-PCR法证实，PCA3基因高度表达于前列腺癌组织，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中仅有少数表达或不表达，在其他肿瘤组织及器官中无表 达，现已成为一种较有应用前景的前列腺癌标记物，它较之单一检测PSA水平筛查前列腺癌具有更高的效能。 

各种研究认为PCA3基因序列中含有高密度的终止密码子，因而PCA3表达非编码的mRNA，而不产生相应的蛋白质。因此，目前检测PCA3的主要方法都是检测PCA3 mRNA。研究还发现PCa组中PCA3 mRNA和PSA mRNA含量显著高于前列腺增生组，PCA3 mRNA和PSA mRNA可作为PCa诊断的良好标志。PSA mRNA诊断PCa的敏感度高于PCA3 mRNA，但特异度较之低，可能是由于PSA mRNA在肿瘤细胞中的表达量高于PCA3 mRNA，而PCA3 mRNA高度特异性地表达于PCa细胞。因此，若将PCA3 mRNA和PSA mRNA联合检测，则可相互弥补PCA3 mRNA敏感度低和PSA mRNA特异性低的不足，从而大大提高对早期PCa的诊断效能。临床评估证明PCA3在前列腺癌的诊断过程中能与PSA检测结合，有效排除前列腺体积、炎症等干扰因素，显著提高前列腺癌的早期诊断价值。PCA3分数＝PCA3 mRNA表达量/PSA mRNA表达量。慢性前列腺炎、前列腺体积、PSA水平对PCA3分数没有影响。在世界多个地区、国家的人群多样本研究中表明，PCA3分数可以有效预测穿刺阳性活检率。 

目前有3种针对PCA3的诊断技术，第一种是以荧光定量PCR技术定量检测PCA3 mRNA的表达；第二种是uPM3技术，是由Bostwick实验室发展的基于核苷酸序列扩增的检验方法；第三种是Gen-Probe公司以APTIMA技术为基础开发分子诊断试剂盒，为目前唯一的商业化试剂盒。国内外各种研究表明，利用荧光定量RT-PCR建立的PCA3评分方法，方法简便、特异且重复性好，为临床应用提供了一种新方法。 

本发明应用Taqman荧光探针技术定量检测尿液样本中PCA3基因和PSA基因的mRNA的表达，然后通过对比两种基因的表达，建立PCA3评分标准，PCA3分 数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。 

发明内容

本发明的目的提供一种可以同时对尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量定量检测体外诊断试剂盒。 

本发明的另一目的在于建立一种对尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量荧光定量PCR检测方法，通过对比PCA3基因和PSA基因表达量，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。 

所述的PCA3/PSA mRNA荧光定量PCR检测试剂盒包括PCA3/PSA-PCR反应液、PCA3/PSA RNA阳性对照、阴性对照、4种已知浓度的PCA3/PSA RNA定量标准品。