[发明专利]一种检测尿液中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法，其特征在于：

为避免PCA3和PSA基因组DNA的干扰，首先跨内含子设计PCA3和PSA的特异性的引物和Taqman荧光探针，2个探针使用不同的荧光染料进行标记，可以在同一反应液中进行扩增和检测，同时加入内参检测引物和探针对样本处理和PCR扩增进行全程监控。然后利用含PCA3和PSA特异性扩增片段的体外转录RNA定量标准品制作标准曲线，对尿液样本中PCA3和PSA mRNA分别进行定量。最后通过对比PCA3基因和PSA基因表达量，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。

2.如权利1所述，PCA3 mRNA检测所用的引物和探针为：

上游引物PCA3-F序列为5′-GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3′；

下游引物PCA3-R序列为5′-GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3′；

荧光探针PCA3-P序列为5′-TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3′，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团。

3.如权利1所述，PSA mRNA检测所用的引物和探针为：

上游引物PSA-F序列为：5′-GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3′；

下游引物PSA-R序列为：5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′；

荧光探针PSA-P序列为：5′-CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3′，5′端标记HEX荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团。

4.如权利1所述，内参基因检测所用的引物和探针为：

上游引物IC-F序列为：5′-TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3′；

下游引物IC-R序列为：5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3′；

荧光探针ICP序列为：5′-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3′，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团。

5.如权利1所述，PCA3标准品中含的特异性扩增片段为：

GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACAGAGGGGAGATTTGTGTGGCTGCAGCCGAGGGAGACCAGGAAGATCTGCATGGTGGGAAGGACCTGATGATACAGAGGTGAGAAATAAGAAAGGCTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCACACATCTGCTGAAATGGAGATAATTAACATCACTAGAAACAGCAAGATGACAATATAATGTCTAAGTAGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAATC。

6.如权利1所述，PSA标准品中含的特异性扩增片段为：

GGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCC。

7.一种PCA3和PSA mRNA核酸荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：PCA3/PSA-PCR反应液、PCA3/PSA RNA阳性对照、阴性对照、4种已知浓度的PCA3/PSA RNA定量标准品。

8.如权利7所述，PCA3/PSA-PCR反应液各成分的终浓度为：1X的反转录PCR缓冲液、4mM的MgCl₂、0.4mM的dNTP、2U的Taq DNA聚合酶、2U的AMV逆转录酶、200nM的PCA3-F、200nM的PCA3-R、150nM的PCA3-P、200nM的PSA-F、200nM的PSA-R、200nM的PSA-P、100nM的IC-F、100nM的IC-R和100nM的IC-P。