[发明专利]猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起怀孕母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状的传染病，俗称猪蓝耳病。乙型脑炎病毒（JEV）又称日本脑炎病毒，是一种人畜共患的病毒性传染病，导致母猪繁殖障碍和人的中枢神经系统疾病，该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展，而且严重威胁人类健康[3-5]。

随着规模化养猪的不断发展，由PRRSV和JEV引起的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失[6]。目前，PRRSV和JEV主要的检测方法有病毒分离鉴定、微量血清中和试验、ELISA、单一病毒RT-PCR，然而这些诊断方法存在操作繁杂、敏感性低、费时费力等不足。

发明内容

本发明的目的是：提供一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，它能够对临床样品中猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，该诊断试剂盒的敏感性好、特异性高。

本发明是这样实现的：猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括100μL DL2000、20μL RT-PCR一步法酶、250μL 酶缓冲液、300μLRNase Free dH₂O、80μL混合引物，各引物的浓度均为10μmol/L、20 μL阳性对照及 20μL阴性对照；混合引物包括PRRSV 上游引物、PRRSV 下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV 上游引物的序列为：5’ –CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA–3’，PRRSV 下游引物的序列为：5’–CAGTATATTGCTCGGCAAACT–3’；JEV上游引物的序列为：5’ –TCCTCGTCATAGGGATTTGCT–3’，JEV下游引物的序列为：5’ –AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG–3’。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为标准猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎RNA RT-PCR产物。

所述的RT-PCR一步法酶由50%的甘油、3 mmol/μL的MgCl2，25mmol/μL的Tris-HCl及0.5μL 反转录酶组成。

所述的酶缓冲液由3 mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的 dNTP 2.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl组成。

为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验：

1 材料与方法

1.1 病毒和细菌

PRRSV北美洲株CH-1a株、JEV弱毒株、PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送。

主要试剂

Goldview、Tris、EDTA、DL2000、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix （RT-PCR一步法酶）、2×1 Step Buffer（酶缓冲液）、RNase Free dH₂O等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。

引物设计

根根据GenBank中的PRRSV ORF7 N基因、JEV NS1基因序列，设计了2对引物，用于扩增目的基因片段，引物的序列如下，PRRSV 上游引物：5’ –CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA–3’，PRRSV 下游引物：5’–CAGTATATTGCTCGGCAAACT–3’，预计目的基因片段大小为245bp；JEV上游引物：5’ –TCCTCGTCATAGGGATTTGCT–3’，JEV下游引物：5’ –AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG–3’，预计目的基因片段大小为504bp。

病毒核酸的抽提