[发明专利]快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境内分泌干扰物，尤其涉及一种快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法。

背景技术

实际环境中，多种环境内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)并存的现状，使得EDCs的复合效应问题引起研究者及管理机构的极大关注。一般情况下，环境中EDCs的存在浓度很低。但毒理学研究发现较弱的雌激素类EDCs以低于各自NOEC(no observed effectconcentration)混合，竟然产生了极为显著的雌激素效应。这就要求我们必须正视环境中低浓度内分泌干扰物的复合效应，开发简单有效的方法对内分泌干扰物复合效应进行评估。

目前对于复合效应的研究主要是应用两种数学模型：剂量(浓度)相加模型和反应相加模型。剂量相加模型适用于相似联合作用，即混合物中各组分通过相同的机制起作用，有相同的作用形式；反应相加模型则适用于独立联合作用，即混合物中各组分产生的效应互相独立，作用形式也不同。如果混合物的实测效应与预测结果基本一致，即为模型所定义的作用；如果实测值与预测值相差较大，则说明有交互作用，即协同或拮抗作用。但这些模型的构建需要大量的数据，实验周期长，费用高，无法满足大规模快速评价，尤其是贴近环境实际浓度的复合效应研究。因此，为了评价实际环境浓度内分泌干扰物复合效应对于生态和人类的安全隐患，开发出一种能够快速、灵敏反映贴近环境真实浓度内分泌干扰物复合效应的评价方法显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的，就是针对现有技术存在的上述缺点，提供一种快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法，可以简单、快速、灵敏、客观的预测内分泌干扰物的复合效应。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法，包括以下步骤：

步骤一、人乳腺癌MCF-7细胞的培养；

步骤二、实时荧光定量PCR获得待测内分泌干扰物剂量-效应曲线；

步骤三、将待测内分泌干扰物混合形成不同浓度配比的暴露液，同时设置含0.1％乙醇细胞培养液对照组，细胞持续暴露24h；

步骤四、暴露结束后，实时荧光定量PCR进行基因转录水平上分析；

步骤五、收集数据进行析因方差分析，绘制边际轮廓图，对待测内分泌干扰物作用机制及其复合效应进行评价；

所述待测内分泌干扰物为17β-雌二醇和o，p'-DDT。

步骤一中所述的培养是将MCF-7细胞用含10％胎牛血清的普通含酚红DMEM培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养。

步骤二中以17β-雌二醇为待测内分泌干扰物作剂量-效应曲线时，其剂量浓度范围设置为0.001pmol/L-10nmol/L；以o，p'-DDT为待测内分泌干扰物作剂量-效应曲线时，其剂量浓度范围设置为0.01pmol/L-10μmol/L；同时设置含0.1％乙醇细胞培养液对照组，细胞持续暴露24h。

步骤三中所述混合形成不同浓度配比的暴露液是指，将17β-雌二醇的浓度设置为0.1pM、1pM和10pM三种，将o，p'-DDT的浓度设置为0.01nM、0.1nM和1nM三种，3×3交叉形成九种不同浓度配比的暴露液。

与现有技术相比，本发明采用基于析因方差分析(ANOVA)的数据统计分析方法，利用人乳腺癌MCF-7细胞雌激素目标基因pS2和PR表达快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应具有独特的优势，其主要特点和优势有：析因方差分析(ANOVA)与其他数据模型相比，所需数据量少，更为简单、快速。同时，细胞实验可顺应伦理要求。而应用于析因方差分析的雌激素目标基因pS2和PR指标对于雌激素效应更为直接和灵敏；由于环境中内分泌干扰物常以低浓度形式存在，对于评价环境相关浓度内分泌干扰物复合效应，该优势更加明显。并且该方法也可能使用于对雌激素和抗雌激素等不同种类内分泌干扰物复合效应的研究。

附图说明

图1、图2是17β-雌二醇(E₂)和o，p′-DDT的剂量-效应曲线。

图3、图4是17β-雌二醇(E₂)和o，p′-DDT二元混合物交互作用边际轮廓图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

受试药物：17β-雌二醇(E₂)、o，p′-DDT，均购自美国sigma公司。