[发明专利]一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法

说明书

技术领域

本发明属布洛芬微生物降解方法技术领域，重点基于从分子水平阐明布洛芬的微生物降解机理，特别涉及定位并敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因的方法。 

背景技术

布洛芬是苯丙酸类非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）的典型代表，属于重要的药物及个人护理药品（pharmaceuticals and personal care products,PPCPs）类物质。大量生产和广泛使用的布洛芬在为人类减轻病痛的同时，也带来了诸多的环境污染危害，已经成为重要的潜在环境污染物之一。 

尽管材料科学家、生态毒理学家、环境化学家和环境工程学家们已经进行了静电纺丝中布洛芬的释放；土壤中布洛芬的淋溶潜能；布洛芬臭氧降解以及布洛芬光芬顿体系降解等的超氧化过程（advanced oxidation processes,AOPs）尝试，但是化学降解存在自身的缺点，因为许多氧化降解的过程是氧化剂和紫外照射的结合（O₃/H₂O₂/UV）或者催化剂和紫外照射的结合（Fe²⁺/H₂O₂；UV/TiO₂），其突出的3个缺点是：（1）过多电能的需求；（2）相当数量氧化剂和催化剂的投入；（3）处理过程pH的控制。上述3点限制了其大规模商业化的应用。 

目前有关布洛芬微生物降解的相关研究集中于降解菌株的筛选以及 提高其降解效率等方面，而对降解菌株降解机制的探究和降解基因的克隆研究甚少，高效降解菌株降解机制的探究和降解基因的克隆研究无疑为安全的布洛芬降解工程菌株的构建和研发奠定了基础。 

尽管布洛芬的微生物降解较化学降解具有优势，但是某些菌株在氧化过程中产生的代谢副产物（羟基布洛芬和羧基布洛芬等）在水环境中显示出与布洛芬相近的毒理效应，因此微生物降解的生态风险仍然存在。筛选安全高效的布洛芬降解菌株，查明菌株降解途径并对该菌株的代谢中间产物和终产物进行毒理效应检测，则会提高该降解菌株用于布洛芬污染环境修复的安全性。高效降解菌株降解机理的探讨和降解基因的克隆研究无疑为安全的布洛芬降解工程菌株的构建和研发奠定了理论基础。 

基因敲除是上世纪80年代后期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，该技术除了可以中止某一基因的表达外，还可以引入新基因及定点突变。上世纪80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1987年，世界上首例小鼠基因打靶试验完成，试验者首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。目前最常用的基因敲除靶细胞是小鼠ES细胞，国际敲除小鼠协会（the International Knock-out Mouse Consortium，IKMC）的成立使得敲除所有小鼠基因的复杂性和费用降低，在其网站可浏览所有IKMC成员生产的载体、ES细胞、小鼠和种质资源等信息。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率很低（约百万分之一），导致筛选基因敲除成功的细胞很困难。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。 

微生物基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA重组系统，该方法为研究微生物基因的功能奠定了重要的技术基础。RecA重组系统是由RecA和RecBCD组成的E.coli内源性同源重组机构。Murphy首先利用噬菌体λ的重组功能采用线性ds DNA构建了重组分子，此研究拉开了用噬菌体λ的Red重组系统在E.coli中建立快速敲除原核基因的序幕。Red重组需要2个基因：redα与redβ。基因α产物是作用于线性ds DNA的5′-3′外切酶；基因β产物结合于ss DNA上，激发互补链退火，但不能促进DNA链的插入和自身交换。噬菌体λ编码的Gam蛋白抑制了宿主细胞中RecBCD的活性，辅助redα与redβ产物的重组功能。应用Red系统进行基因敲除可直接利用线性打靶DNA，两侧同源臂长度为35-60bp即可发生同源重组且重组效率高。Murphy研究表明λ-Red介导的重组率比RecA重组系统高10-100倍。因为被引入受体的噬菌体编码的蛋白质促进了同源重组，Red同源重组操作在E.coli以及其他细菌菌株中均是可行的。