[发明专利]一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法

权利要求书

1.一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

（1）以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5；

（2）使用布洛芬邻苯二酚2,3-双加氧酶基因（Ipf C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的Ipf C23O基因来对步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在；

（3）以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞；

（4）将λ-red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤（3）得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于添加氯霉素和氨苄青霉素的LB双抗平板筛选到阳性转化子4F6-pKD46菌株；

（5）以步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5为模板,使用ipf23O F和R引物分别PCR扩增出突变体G9和H5中的线性DNA；制备步骤（4）所得到的阳性转化子4F6-pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46菌株中，于添加氯霉素和四环素的LB双抗平板筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株；

（6）消除步骤（5）所得的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株中的重组质粒pKD46；使用ipf23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体；

（7）对步骤（1）和步骤（6）所得的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5以及步骤（1）中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性（MC）测定。

2.根据权利要求1所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述步骤（2）、步骤（5）和步骤（6）中的PCR反应引物为：Ipf C23OF:5'-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3'；Ipf C23OR:5'-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3'；反应条件为：95℃5分钟;95℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，35个循环;72℃10分钟。

3.根据权利要求1或2所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述步骤（3）中制备菌株4F6的感受态细胞的方法具体为：转移600μL4F6菌株的过夜培养液至5.4mL添加氯霉素的LB培养液中，37℃培养3小时；上述培养液分装至1.5mL离心管，14,000rpm离心1.5分钟，弃上清，重复离心2次；用1mL300mM的冰冻蔗糖洗涤上述细胞3次，再次悬浮至100μL冰冻蔗糖中获得上述感受态细胞。

4.根据权利要求1或3所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于：步骤（3）-（5）中的LB培养基中氯霉素终浓度为12.5μg/mL，氨苄青霉素终浓度为150μg/mL，四环素终浓度为5μg/mL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，其中涉及到的4株菌株均为大肠杆菌Escherichia coli，菌株名称、保藏编号和分类命名分别是：

4F6菌株，保藏编号为CGMCC No.6719，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株；

4F6-H5菌株，保藏编号为CGMCC No.6720，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6的Tn5转座子插入突变株；

4F6-G9菌株，保藏编号为CGMCC No.6721，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6的Tn5转座子插入突变株；

3G7菌株，保藏编号为CGMCC No.6722，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株。