[发明专利]龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。

背景技术

龟甲为龟科动物乌龟chinemysreevesii(Gray)的干燥腹甲及背甲。龟甲中含动物胶、角蛋白、脂肪、骨胶原、氨基酸，及钙、磷、锶、锌、铜等多种常量及微量元素，性平。有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效；用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，血虚伪黄，失眠健忘等症。为常用贵重药材。其药材主产于湖北、安徽、湖南、江苏、浙江等地。近年来，由于市场需求量大，货紧价高等原因，一些产自东南亚国家的龟甲也通过这种渠道汇入我国，致使基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响到龟甲临床用药的安全、疗效。因此，开展科学的中药鉴定对于中药的临床及中药现代化事业的发展具有重大的意义。

传统鉴定方法主要是性状、显微、理化鉴定等。性状鉴定主要是形、色、气、味、质地等，该方法简便、快捷。显微鉴别是通过显微镜观察药材组织、细胞及后含物等特征来区分各类中药。对性状相似多来源生药及丸、散、片、丹等中成药方剂的鉴定有独到之处。对于有效成分或特征成分明确的中药则可运用理化鉴定的方法进行，通过物理或化学方法对药及其制剂中所含有的主要化学成分或特征成分进行定性和定量分析，用以达到鉴定药材真伪的目的。近年来，在薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外光谱、气相色谱、质谱等方法广泛应用的基础上，气-质联用、各种色谱-光谱联用技术也被用于中药的理化鉴定。但是由于我国中药材种类繁多，许多药材的化学成分仍不明确，还有一些近缘物种的化学成分十分相似，这些药材在进行理化鉴定时仍有一定的局限性。

分子遗传标记技术开始与中药领域渗透，并快速融合、发展，其中DNA指纹图谱在中药材(除矿物药外)的鉴定方面具有专属性强，准确性高，重复性好等优点，从分子水平解决了以前中药鉴定中宏观鉴定水平上的不完善。现代分子生物学在中药的质量控制领域逐步扩大，方法逐渐完善，大大加快了中药现代化的进程。

线粒体是存在于真核细胞内的一种细胞器，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点。其中细胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)基因和细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I，Cox I)基因存在于所有动物中，进化速度适中，较短的一个片段就能包含从种内到种间信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能够保证足够变异，是分析种内和近缘种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。这两个片段的基因可被作为动物中物种鉴定标记进行研究，因此，以线粒体DNA分子特征为遗传标记的中药鉴定更为准确、可靠。

我们依托吉林省科技厅(2008年1月立项)和吉林省教育厅资助课题(2010年1月立项)：《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》(2012年5月吉林省科技厅鉴定成果)，基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出貂心、鹿鞭和鹿茸三种中药材DNA鉴定试剂盒。

课题组在发现貂心线粒体DNA的全部基因组前提下，利用貂心mtDNA独特的优势，应用DNA扩增技术及测序技术研究貂心线粒体DNA的基因组部分序列，设计的寡核苷酸片段可特异鉴定鸡心、鸭心、鹅心和兔心，成功发明了一种简便、快速、特异的鉴定貂心专利技术(貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法，发明专利：ZL200810051643.3；2011.4授权)。相关成果发表在吉林大学学报《貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征》[2008，34(5)：790-793]，中国药学杂志《貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析》[2008，4(3)：182-185]。时珍国医国药杂志《貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究》2010年04期

在此基础上，课题组应用分子生物学与中药鉴定的相融合的理论对龟甲的鉴定技术进行研究，主要应用线粒体DNA的Cyt b高保守性及特异性对龟甲进行鉴定。采用盐析法方法从龟甲中提取线粒体DNA，利用Genbank中的相关信息，根据龟甲与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取Cyt b基因序列，应用primer premier5.0引物设计软件设计龟甲一对特异性引物，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，此方法可从分子水平对龟甲鉴定提供依据。相关成果发表在中国药学杂志《中药材龟甲细胞色素b特异性鉴定研究》[2012，4(3)：182-185]。