[发明专利]龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种龟甲DNA检测试剂盒，其特征是，它包含样本前处理液及脱钙液、线粒体DNA提取体系、PCR反应体系、结果观察体系。

(1)样本前处理液及脱钙液

(a)前处理液：去离子水。

(b)脱钙液：0.5mol/L pH8.0EDTA。

(2)线粒体DNA提取体系

(a)裂解液：10m mol/L Tris-HCl(pH8.0)，10m mol/L EDTA(pH8.0)，100m mol/L NaCl，2％SDS，40μg/ml蛋白酶K，0.039mol/L DTT。

(b)沉淀液：饱和NaAC。

(c)洗涤液：70％乙醇。

(3)PCR反应体系

(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，中华龟龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(c)阴性对照反应体系：总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水；

(4)结果观察体系

(a)琼脂糖凝胶：1.5％琼脂糖。

(b)标准分子量：100～2000bp的DNA Marker(可以选用其它种类的标准分子量，要求最大的不能超过2000bp，要显示出100bp和400bp)。

2.龟甲DNA鉴定方法，其特征是，它包含检测样本前处理、线粒体DNA提取、PCR引物设计与合成、建立PCR反应、结果判定五个步骤。

(1)检测样本前处理

每个样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2～3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1∶20加入相应体积脱钙液，56℃水浴48h～60h，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱钙后8000r/min离心5min弃上清，沉淀待用。

(2)线粒体DNA提取

(a)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56℃水浴过夜，转速100r/min。

(b)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6,000r/min4℃离心10min，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20～30min，12,000r/min4℃离心20min，弃上清，留沉淀。

(c)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀干燥，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。

(3)PCR引物设计与合成

(a)设计龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，含有龟甲DNA序列，如下Primer1、Primer2：

Primer1(COX I)

5′  ATACATCCGATACAACAGC  3′

5′  GATAAATGGGAGATAAGTG  3′

Primer2(cyt b)

5′  ATCATCCGATCAATAACAG  3′

5′  AGGGAGAATAATAAAGTGAAA  3′

(b)人工合成龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪。(委托上海生工完成)

(4)建立PCR反应

(a)鉴定反应：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM引物1和引物2各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(b)阳性对照反应：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，中华龟龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(c)阴性对照反应：总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水。

(d)设计反应程序

分别将鉴别龟甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行：

94℃预变性3-7min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃1min，40个循环，72℃延伸5-8min，4℃。

(5)结果判定

产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，分子量100-2000bp的DNA Marker(标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。同时出现100bp和400bp条带为正品龟甲，只出现一条或不出现均为伪品龟甲。