[发明专利]高效表达重组细菌素的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效表达重组细菌素的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

近十年来，随着我国科学技术飞速的进步，畜牧业也得到了持续稳定的发展，并成为国民经济的支柱产业。然而兽药及药物性饲料添加剂在促进养殖业生产发展的同时，由于对其长期及不规范使用，也带来了严重的负面影响：一是养殖业大量使用抗生素造成的病原菌耐药性越来越严重，造成抗生素用量逐年增加，这不仅导致了养殖成本的增加，更严重威胁人类安全，如2010年曾引起民众恐慌的超级耐药菌（携带NDM-1基因）足以为证；二是由于抗生素的持续添加导致动物性产品药物残留，可能引发致癌、致畸作用严重危害人体健康；三是药物残留及其代谢产物随粪尿排除，污染环境。从发展看，在食用动物中禁用限用抗生素饲料添加剂已经成为世界共识，是大势所趋。因此，为了控制药物残留、提高食品安全及畜牧业的可持续发展，迫切需要开发新型抗生素替代品。而细菌素因其优良的抗菌特性、生物相容性和安全性成为了抗生素的理想替代品。

屎肠球菌是美国、我国及多个国家在动物和人上允许使用的益生菌，其某些菌株能够产生细菌素，而细菌素E50-52是由Enteroco ccus faecium(NRRL B-30746)产生，由39个氨基酸组成，其氨基酸序列为：TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWL CKLA（SEQ ID No.2），不含N端前导肽或信号序列等外延序列，为IIa类的细菌素；在100℃处理15min或在pH3.0-8.4条件下仍保持稳定，而乳酸链球菌素（Nisin）在中性和碱性条件下会大量失活。与Nisin相比，细菌素E50-52有更加广泛的热和酸碱稳定性。可见，IIa类细菌素E50-52抗菌活力高、源于益生菌、能特异性杀死病原菌、高热和酸碱耐受性，具有重要的应用价值。但是，目前天然产生菌株产量低，分离纯化难度大，严重制约了其在生产中的应用。而运用分子生物学或基因工程技术提高细菌素的产量是一种有效可行的方法。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种细菌素E50-52基因。

本发明的第二个目的在于提供一种高效表达重组细菌素E50-52的基因工程菌及其构建方法。

本发明的第三个目的在于提供一种所述重组细菌素E50-52的制备方法。

本发明提供了一种细菌素E50-52基因，其核苷酸序列如SEQ I D No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有所述细菌素E50-52基因的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体为pET-SUMO-E50-52，其中，SUMO为小分子泛素样修饰蛋白。

所述重组表达载体pET-SUMO-E50-52的构建方法为设计并合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的细菌素E50-52基因，将合成的细菌素E50-52基因克隆到T载体上，构建T-E50-52载体，以测序验证正确的T-E50-52载体为模板，以引物F和引物R为引导进行PCR，将PCR产物克隆至融合表达质粒pET-SUMO上，构建重组表达载体pET-SUMO-E50-52，经PCR扩增、测序验证正确即得。

其中，引物F：ACCACCAAAAACTATGGCAAC（SEQ ID No.3）

引物R：TCACTATTACGCCAGTTTGCACAG（SEQ ID No.4）

本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞为大肠杆菌Mach1^TM-T1^R或BL21(DE3)。

其中，所述大肠杆菌Mach1^TM-T1^R用于保存和扩增重组表达载体pET-SUMO-E50-52，而大肠杆菌BL21(DE3)则用来表达重组细菌素E50-52。

所述宿主细胞的构建方法为将测序正确的重组表达质粒pET-S UMO-E50-52转化大肠杆菌Mach1^TM-T1^R或BL21(DE3)细胞。

本发明提供了一种高效表达重组细菌素的基因工程菌，所述基因工程菌是携带pET-SUMO-E50-52重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)，能够表达重组细菌素E50-52。