[发明专利]一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法

说明书

技术领域

本发明属于Rtn4基因领域，特别涉及一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法。

背景技术

Rtn4（亦称Nogo）蛋白是网状蛋白家族4（reticulon protein family4，Rtn4）中的一员，位于11号染色体，长度近50kb，由11个外显子和8个内含子组成，该家族包括RTN4-A,B,C三种蛋白。其中，Rtn4-A和B为RTN4基因经同一启动子以不同方式选择性剪接后所得，两者具有相同的羧基端序列（含188个氨基酸残基）。Rtn4-A主要表达于中枢神经系统，外周组织中仅睾丸和心脏组织中有少量表达。Rtn4-B广泛表达于外周器官及组织，包括肺脏、心血管组织等，主要参与机体炎症反应过程中的调控以及组织损伤后的修复，此外还涉及肿瘤细胞凋亡、神经元退行性变等病理生理过程，但具体作用机制目前尚不明确。Rtn4-A/B在脑、脊髓、心脏、肾脏、肺脏、肝脏等外周组织中广泛表达，主要参与机体炎症过程中的调控以及组织损伤后的修复。研究显示，使用Rtn4-A/B^-/-小鼠构建缺血性损伤模型后，损伤部位的巨噬细胞数目减少，血管再生能力下降，而移植野生型巨噬细胞后，血管再生以及创伤修复的能力明显得到改善。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，该方法有效敲除小鼠Rtn4-A、B1、B2的基因表达，而对其他Rtn4亚型表达无明显影响，为深入研究Rtn4-A/B的生物学功能奠定了基础。

本发明的一种Rtn4-A/B基因敲除方法，包括：

（1）将与Rtn4-a/b基因同源的5’和3’臂、标记有NEO抗性基因的表达框敲入BAC打靶载体以替换欲敲除的rtn4-a/b基因区域；将得到的Rtn4-A/B-KO质粒DNA用Not I线性化，消化过夜，等体积酚氯仿、氯仿处理，无水乙醇沉淀，用无菌PBS将线性化后的质粒DNA重悬备用；

（2）使用线性化后的Rtn4-A/B-KO DNA对ES细胞进行细胞转染，用量为30～50μg；抽提抗性克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定，即可。

所述步骤（1）中的5’臂含2888bp碱基，3’臂含4398bp碱基。

所述步骤（1）中的NEO两端Frt序列被Flp重组酶识别从而将NEO基因剔除。

所述步骤（1）中的Not I与Rtn4-A/B-KO质粒的用量比为1.5U:1μg。

所述步骤（1）中在37℃下消化过夜。

所述步骤（2）中的ES细胞为SCR012细胞。

所述步骤（2）中细胞转染时电穿孔条件为电压240v，电容500μF,实际通电时间10.9ms，实际电压258v；克隆筛选条件：300μg/ml G418和2μM GanC筛选8天。

所述步骤（2）中5’臂的引物分别为P1：5’-TGAGCTTCATTGATGTTCCTGGTTATT-3’；P2：5’-CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC-3’；目的片段为3.4kb，PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，63℃30s，72℃3min，共35个循环。

所述步骤（2）中3’臂的引物分别为P3：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’；P4：5’-ATGATATAAGCTCAAGTGATCCTGCAG-3’；目的片段为5.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，63℃30s，72℃5min，共35个循环。

本发明构建基因打靶载体的策略是利用同源重组的方法，特异性敲除rtn4基因位于10kb左右的9887-11167区域，即Rtn4-005、Rtn4-006、Rtn4-007、Rtn4-008转录本的第1外显子以及Rtn4-201转录本的第1外显子、第1内含子及第2外显子。采用该基因敲除方法，可有效敲除Rtn4-A,B1,B2的基因表达，而对其他Rtn4亚型表达无明显影响。由于Rtn4-A蛋白特异性表达于中枢神经系统，在外周仅心脏及睾丸组织中有少量表达，Rtn4-D也特异性表达于睾丸组织，而Rtn4-B在外周组织中有广泛表达。因此，并不会因为Rtn4-A的同时敲除而影响Rtn4-A/B在外周组织中功能的研究。

有益效果

本发明有效敲除小鼠Rtn4-A、B1、B2的基因表达，而对其他Rtn4亚型表达无明显影响，为深入研究Rtn4-A/B的生物学功能奠定了基础。

附图说明