[发明专利]一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法

权利要求书

1.一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，包括：

（1）将与小鼠Rtn4-a/b基因同源的5’和3’臂、标记有NEO抗性基因的表达框敲入BAC打靶载体以替换欲敲除的rtn4-a/b基因区域；将得到的Rtn4-A/B-KO质粒DNA用Not I线性化，消化过夜，等体积酚氯仿、氯仿处理，无水乙醇沉淀，用无菌PBS将线性化后的质粒DNA重悬备用；

（2）使用线性化后的Rtn4-A/B-KO DNA对ES细胞进行细胞转染，用量为30～50μg；抽提抗性克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定，即可。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（1）中的5’臂含2888bp碱基，3’臂含4398bp碱基。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（1）中的NEO两端Frt序列被Flp重组酶识别从而将NEO基因剔除。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（1）中的Not I与Rtn4-A/B-KO质粒的用量比为1.5U:1μg。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（1）中在37℃下消化过夜。

6.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（2）中的ES细胞为SCR012细胞。

7.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（2）中细胞转染时电穿孔条件为电压240v，电容500μF,实际通电时间10.9ms，实际电压258v；克隆筛选条件：300μg/ml G418和2μM GanC筛选8天。

8.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（2）中5’臂的引物分别为P1：5’-TGAGCTTCATTGATGTTCCTGGTTATT-3’；P2：5’-CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC-3’；目的片段为3.4kb，PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，63℃30s，72℃3min，共35个循环。

9.根据权利要求1所述的一种小鼠Rtn4-A/B基因敲除方法，其特征在于：所述步骤（2）中3’臂的引物分别为P3：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’；P4：5’-ATGATATAAGCTCAAGTGATCCTGCAG-3’；目的片段为5.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，95℃30s，63℃30s，72℃5min，共35个循环。