[发明专利]使用AFLP的高通量物理作图

说明书

本申请是申请号为200780025146.X，申请日为2007年7月10日，发明名称为“使用AFLP的高通量物理作图”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域。具体地，本发明涉及核酸检测和鉴定领域。更具体地，本发明涉及使用高通量测序技术产生基因组或其一部分的物理图。

背景技术

完整的遗传和物理基因组图在以图为基础的基因分离、比较基因组分析和作为基因组测序计划中序列准备（sequence-ready）克隆的来源中极其有用。获得物种的完整物理和遗传标记图对于基因组研究具有巨大作用。完整图允许精确快速的基因作图和微卫星位点和SNP标记的精确作图。人们已经开发了多种组合具有不同复杂性的基因组物理图的方法。其中一种较好描述的方法使用限制性酶来从基因组亚克隆中产生大量DNA片段（Brenner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,（1989）,86,8902-8906;Gregory et al.,Genome Res.（1997）,7,1162-1168;Marra et al.,Genome Res.（1997）,7,1072-1084）。对这些指纹进行比较以鉴定相关克隆并组合重叠群中的重叠克隆。然而，由于DNA在胶与胶之间迁移不同、存在重复DNA、限制性位点分布异常和克隆表现度（representation）不对称，指纹法在对复杂基因组的巨大插入克隆排序中用处有限。因此，大部分复杂基因组的高质量物理图通过联合指纹法和基于PCR或基于杂交的方法来构建。然而，使用指纹技术的一个缺陷是它基于片段模式匹配，其是一种间接的方法。

人们更希望通过产生基于实际序列数据的重叠群来产生物理图，即一种更直接的方法。基于序列的物理图不仅更精确，同时也在测定目标物种的完整基因组序列中有用。最近已经获得的高通量测序方法能以更高效更经济的方式测定克隆的完整核苷酸序列。

然而，通过测序整个限制性片段来进行检测仍然相对不经济。此外，如本文其他部分所揭示的本领域现有测序技术水平（从454Life Sciences,www.454.com,Solexa,www.solexa.com和Helicos,www.helicosbio.com），尽管它们具有极大的测序能力，它们也只能提供有限长度片段的测序。目前的方法也不能在一次运行中同时处理多个样品。

本发明的目的是设计和描述基于联合限制性消化、建库（pooling）、高精确扩增和高通量测序来高通量产生物理图的策略。通过使用这种方法，可产生甚至是复杂基因组的物理图。

定义

在下面的说明和实施例中使用了一些术语。为了提供对于说明书和权利要求书的清晰一致的理解，包括指定这些术语的范围，提供了下面的定义。除非本文另外定义，所使用的所有技术和科学术语具有和本发明所属领域的普通技术人员的常规理解相同的含义。将公开的所有出版物、专利申请、专利和其它文献以其整体通过引用纳入本文。

核酸：根据本发明，核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基的任意多聚体或寡聚体，嘧啶和嘌呤碱基分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤（参见Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,793-800（Worth Pub.1982），其通过引用被整体引入本文以用于本文的所有目的）。本发明考虑了任意的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，以及它们的任意化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式，等等。该多聚体或寡聚体在组成方面可以是异源的或同源的，并且可以分离自天然产生的来源或者可以是人工或合成生产的。此外，核酸可以是DNA或RNA，或者它们的混合物，并且可以以单链或双链形式永久或暂时存在，双链形式包括同源双链、异源双链和杂交状态。

AFLP：AFLP是指一种选择性扩增核酸的方法，该方法基于用一个或更多个限制性内切酶消化核酸以产生限制性片段，将接头连接到该限制性片段上以及扩增接头连接的限制性片段，所述的扩增使用至少一个（部分的）与该接头互补、（部分的）与限制性内切酶的剩余部分互补并且进一步包含至少一个选自A、C、T或G（或U，在可能的情况下）的随机选择的核苷酸的引物。AFLP不需要任何已有的序列信息，可在任何起始DNA上进行。一般而言，AFLP包括下述步骤：