[发明专利]使用AFLP的高通量物理作图

权利要求书

1.一种用于鉴定限制性片段的克隆来源的方法，包括：

a）提供样品DNA；

b）产生人工染色体克隆库，其中每个人工染色体克隆包含部分该样品DNA；

c）将所述人工染色体克隆组合到一个或更多个库中以产生文库，其中每个克隆存在于一个以上的库中；

d）用一个或更多个限制性内切酶消化所述一个或更多个库以便为每个库都提供一组限制性片段；

e）将接头连接到该限制性片段的一边或两边以提供接头连接的限制性片段，其中至少一个接头含有库特异性鉴定因子或简并鉴定因子部分；

f）测定至少库特异性鉴定因子和部分限制性片段的序列；以及

g）使用库特异性鉴定因子将步骤f）的限制性片段序列分配到相应克隆中，其中库特异性鉴定因子鉴定限制性片段的克隆来源。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过对在（部分）限制性片段中含有同样的序列但带有不同的库特异性鉴定因子的接头连接的限制性片段进行聚类，将所述的限制性片段分配到相应的克隆中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在测序之前，扩增接头连接的限制性片段以产生扩增子。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的测序通过高通量测序的方式进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的高通量测序在固相支持物上进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述的高通量测序基于合成测序。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述的高通量测序包括步骤：

·将所述的扩增子或接头连接的限制性片段退火到珠子上，每个珠子和单个接头连接的限制性片段或扩增子进行退火；

·乳化在油包水微反应器里的珠子，每个油包水微反应器包含单个珠子；

·进行乳化PCR以扩增珠子表面的接头连接的限制性片段或扩增子；

·可选地，选择/富集含有扩增的扩增子的珠子；

·把珠子装载入孔中，每个孔含有单个珠子；以及

·产生焦磷酸信号。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述的高通量测序包括步骤：

·分别将所述的接头连接的限制性片段或扩增子退火到含有第一和第二引物或第一和第二引物结合序列的表面上；

·进行桥式扩增以提供扩增的接头连接的限制性片段簇或扩增的扩增子簇；

·使用标记的可逆终止核苷酸确定扩增的接头连接的限制性片段或扩增的扩增子的核苷酸序列。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的鉴定因子为从4至16bp，优选从4至10，更优选从4至8，最优选从4至6bp。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的鉴定因子不含有2个或更多个相同的连续碱基。

11.根据权利要求1所述的方法，其中对于两个或更多个克隆，相应的鉴定因子含有至少两个不同核苷酸。

12.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中使用在其3’端带有1至10个，优选从1至4个，选择性核苷酸的至少一个引物进行接头连接的限制性片段的扩增，以提供随机的扩增子亚组。