[发明专利]一种用于肺癌预后评价的基因检测试剂盒及其制备与用途

权利要求书

1.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，包括与肺癌预后密切相关的5个基因的多重PCR扩增引物序列和固定了该5个基因探针的芯片；其中，所述的与肺癌预后密切相关的5个基因为蛋白激酶C iota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1、乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2和八聚体结合转录因子4。

2.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，其包括：固定了如权利要求1所述的与肺癌预后密切相关的5个基因探针的芯片，即通过标记探针的基团与包被芯片的结合基团结合固定，芯片中还含有阴性对照探针。

3.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，如权利要求2所述的所述基因芯片为巯基包被芯片、链霉亲和素包被芯片或羧化葡聚糖包被芯片。

4.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，如权利要求3所述的基因芯片优选为链霉亲和素包被芯片。

5.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，其包括：人肿瘤组织DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性对照、阳性对照和DNA杂交液；

其中，人肿瘤组织DNA提取液包括：去离子水、6M NaI、氯仿/异戊醇混合液、异丙醇和无水乙醇；

PCR扩增反应液包括：10×PCR缓冲液、2U-5U的Taq酶、0.2～1.0mM的dNTPs以及权利要求1所述的5个基因的多重PCR引物混合物，该扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol；

阴性对照为DEPC去离子水；

阳性对照为构建的5个基因质粒DNA；

DNA杂交液为50％甲酰胺、6×SSC、0.5％SDS、5×Denharde’S试剂、5％硫酸葡聚糖、200mg/L变性的鲑精DNA。

6.一种用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，其使用步骤如下：

取来自肺癌患者肿瘤组织1-2克，按肿瘤组织DNA抽提纯化的方法抽提肿瘤组织中DNA，取2μl用1×TAE缓冲液加热溶解的m/v为1％的琼脂糖凝胶进行电泳；以及取2μl用1×TAE缓冲液稀释50倍，进行DNA定量；

获取的肺癌患者肿瘤组织DNA后，提取的DNA为PCR模板进行扩增，PCR扩增反应条件如下：

1)PCR反应体系如下：

针对与肺癌预后密切相关的5个基因的扩增反应体系为一个使用肿瘤组织提取DNA为模板的PCR，使用如权力要求1所述的5个基因的多重PCR扩增引物；

2)将配制好的PCR反应体系放入PTC-100PCR仪中，应用扩增程序如下：94℃5分钟；94℃30秒，45℃30秒，72℃40秒，15个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒，30个循环；72℃10分钟，4℃保持；

3)链霉亲和素修饰的包被传感芯片上固定生物素标记探针：针对与肺癌预后密切相关的5个基因的杂交体系，使用如权力要求2所述的5个基因的探针序列；系统缓冲液为HBS-EP，反应在45℃下进行；靶探针分别溶于HBS-EP中，在基因芯片点样仪上以5μl/分钟300μl注入芯片表面流池，阴性对照探针溶于HBS-EP以5μl/分钟300μl注入对照流池；反应完成后，包被探针的芯片表面以50μl/分钟分别注入0.01％SDS100μl，5mM HCl100μl再生液老化芯片表面；反应结束后系统缓冲液200μl/分钟30分钟平衡芯片表面；

4)PCR扩增靶序列的杂交

将包被好探针的基因芯片装入等离子共振仪上，调节表面等离子共振仪温度至45℃，检测池中用HBS-EP以150μl/分钟流速冲洗2分钟，获得稳定基线；将10μl PCR产物加入到90μl杂交缓冲液中，95℃孵育5分钟后立即放入冰上，于表面等离子共振仪中进样进行杂交反应，以3μl/分钟进行30min反应；

5)共振信号测定和结果判定

反应完成后，用杂交缓冲液以5μl/分钟洗脱，表面等离子共振仪自动检测出基因杂交反应共振信号RU；当杂交信号检测得到的RU值高于临界值10以上，表明该肺癌患者高表达该5个基因。

7.一种如权利要求5或6所述的用于肺癌预后评价相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述HBS-EP缓冲液的pH为7.4。