[发明专利]一种从猪皮中提取I型胶原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工分离领域，具体地，本发明涉及一种类型均一的胶原制备方法。

技术背景

胶原是一种由动物细胞表达的天然生物高分子，作为细胞外基质的主要成分几乎存在于所有组织，约占哺乳动物体内总蛋白的33％。胶原对于维持组织的结构与机械强度十分关键，胶原与蛋白和多糖等相互作用构成复杂的网状结构，不仅起到细胞结构支架的作用，而且对细胞和组织的形态结构、新陈代谢、生长、分化都有重要影响。胶原由3条链组成，每条肽链约1000个氨基酸残基，根据其每条链的氨基酸组成差异，胶原可分为多种类型，目前在哺乳动物体内已发现27种不同类型的胶原，不同类型胶原的性质存在一定差异。

胶原具有良好的生物相容性、弱抗原性、生物可降解、生物可吸收性以及良好的吸水性，胶原作为一种理想的生物材料，可用于组织工程、医疗器械、组织修复、药物控释和动物细胞培养等领域，如胶原可用于制造人工器官、止血材料、组织修复与再生材料、组织填充材料、支架材料、神经缺损修复材料以及动物细胞培养等。不同类型胶原的功能、机械强度及其热稳定性存在一定差异，与其它生物分子、细胞或材料界面之间的相互作用也存在一定差异，因此，制备不同生物材料对胶原类型及其比例等存在一定要求。

在组织工程材料方面，Ohno T等证明使用胶原制备三维支架接种软骨细胞并用于软骨组织修复和再生时，I型和II型胶原对结果影响十分显著(Materials Science and Engineering:C，2004，24-3:407–411)；胶原蛋白用于制备止血材料方面，不同类型的胶原与血小板之间的相互作用也存在一定差异，如Zhu JQ证明血小板表面上存在可与不同类型胶原结合的活性位点，且结合位点种类与胶原类型密切相关(Thrombosis Research，2007,119-1:111-119)。在组织再生材料方面，I型和III型胶原对于膀胱壁的无细胞基质的移植和再生效果影响十分显著(European Urology Supplements,2003，2-1：121)。因此，提高胶原的类型均一性对改进组织工程产品或医疗器械等产品十分关键，制备类型均一的胶原具有广阔的应用前景。

由于胶原在天然状态下不溶于水溶液，直接分离不同类型的胶原存在一定难度，也是近年来的生物材料领域中胶原研究的热点。范代娣等采用基因工程的方法制备了一种重组胶原蛋白(范代娣，马晓轩，严建亚等，重组胶原蛋白，专利申请号CN102351954.A)，杨树林等采用基因重组的方法制备了人III型胶原的具有序列(一种重组人源胶原蛋白及其制备方法申请号102443057.A)。基于基因的胶原制备技术不同于以动物皮肤或骨为原料制备胶原的方法，其成本较低，制备的胶原纯度较高，但基因重组技术只能制备出胶原的一条链活局部序列，而在制备具有三螺旋结构的胶原方面存在难度。任伟业申请的一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法(申请号CN102391372.A)公开了一种制备具有三螺旋结构胶原的方法，但该方法只能制备出混合胶原，而不涉及不同类型胶原的分离。李洁等以动物软骨为原料，经过粉碎后采用胃蛋白酶进行降解，采用盐析和离心的方法获得非变性II型胶原蛋白(李洁、朱大开，龚辉，非变性II型胶原蛋白生产方法，专利申请号CN 102154425.A)，该过程需要反复的盐析处理和离心过程。蒋波等采用新鲜新生牛皮为原料，采用酶解、盐析、变性和复性的技术制备了牛III型胶原(蒋波，李霞、陈露等，医用级III型胶原的制备方法，申请号200910216686.7)，该专利用于制备牛III型胶原。从实际应用效果分析，已有方法制备的胶原纯度以及胶原的分子量范围存在不稳定性，用于制备生物材料时，尤其是对I型胶原纯度要求较高的生物材料时，其应用效果难以满足实际要求。

不同类型胶原的热变性温度存在一定差异，热变性后的胶原可通过非胶原类的酶进行降解。因此，通过温度控制可实现不同类型胶原的变性，加入酶后可实现不同类型胶原的选择性酶解，是实现分离不同类型胶原的一种良好方法。

发明内容

针对I型胶原制备难度高以及医疗器械类生物材料对I型胶原纯度要求高的情况，本发明目的在于提供一种从猪皮中提取I型胶原的方法，制备的猪I型胶原纯度超过98％且保持三螺旋的天然结构。本发明的一种从猪皮中提取I型胶原的方法，该方法包括以下步骤：

(1)称重：取新鲜的猪皮，准确称重，其重量作为后续处理步骤的计量依据。

(2)清洗：使用2-3倍猪皮重量的清水在常温下将新鲜的猪皮直接清洗，去除附着物。