[发明专利]一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除莠剂合成、有机合成中间体等方面。2006年世界丙酸总生产能力在35万吨/年左右，2008年达到50万吨/年。美国是世界上最大的丙酸生产及消费国。目前我国丙酸实际年产量只有200吨左右，远远不能满足实际的市场需求，每年仍需大量进口来弥补国内的空缺。

詹氏丙酸杆菌（Propionibacterium jensenii）属于丙酸杆菌属，为厌氧菌，是一类G⁺、不产芽孢、不运动、接触酶阳性的厌氧菌。菌落呈现白色、黄色或者褐红色。一般情况下，最适pH为6.5～7.5，最适生长的温度为28℃～37℃。

丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法是以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸的方法，该方法是工业级规模上丙酸的主要生产方法。微生物发酵法是丙酸菌在常温、常压下利用一般营养源通过自身代谢产生丙酸。由于微生物发酵生产丙酸能降低对石油等不可再生能源的依赖性，减轻对环境造成的压力，因此，在当前全世界面临环境污染、能源短缺的严峻情况下，微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注。但是微生物法生产丙酸仍然存在成本高，丙酸产量低等缺点。丙酸杆菌的主要碳源是甘油，然而在其代谢途径中，詹氏丙酸杆菌对甘油的利用率并不高，从而导致碳源转化成产物的效率低下，最终导致丙酸产量低。因此，需要过量表达甘油代谢途径中的第一步中的相关酶即甘油脱氢酶基因（gldA）以提高丙酸杆菌对甘油的利用率，最终达到提高丙酸的产量的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产丙酸的詹氏丙酸杆菌工程菌，是将肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia subsp.pneumoniae ATCC12657）中甘油脱氢酶基因gldA克隆到詹氏丙酸杆菌CCTCC NO:2013071构建而成的詹氏丙酸杆菌工程菌。

所述甘油脱氢酶基因如NCBI-Gene ID:150953431所示。

所述甘油脱氢酶基因通过表达载体pZGX04进行表达。

本发明详细技术方案为：是利用分子手段，将来源于肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumonia）中编码甘油脱氢酶gldA基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株詹氏丙酸杆菌Propionibacterium jensenii CCTCC M NO:2013071中，以提高甘油的利用率，从而提高甘油代谢途径通量，并最终导致丙酸生产强度以及产量的提高。

所述表达载体pZGX04是由野生质粒pZGX、NCBI编号为NCBI-Gene ID:JQ728013、pUC18、NCBI编号为NCBI-Gene ID:L08752以及氯霉素抗性基因NCBI编号为NCBI-Gene ID:NC_004774构建而成。

通过用限制性内切酶EcoRI and BamHI双酶切pZGX得到的大片段连接至同样酶切处理的pUC18，之后用NheI酶切得到的载体然后使其自连，最后用StuI处理上述载体后连接氯霉素抗性基因（1.5Kbp），得到pZGX04。

以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia subsp.pneumoniae ATCC12657全基因组序列为模板，PCR扩增得到或采用化学全合成的方法获得gldA目的片段（1Kbp）。通过平末端连接将其克隆入质粒pZGX04，得到gldA基因表达质粒pZGX04-gldA。构建好的重组质粒pZGX04-gldA经DNA测序证明，表明重组质粒构建正确。将重组质粒用电击转化的方法，转入受体菌Propionibacterium jensenii CCTCC M NO:2013071，在SLB培养基上进行随即挑选，利用菌落PCR的方法进行筛选，得到甘油脱氢酶过量表达的重组菌Propionibacterium jensenii CCTCC M2013071-gldA。

本发明还提供了一种提高詹氏丙酸杆菌产丙酸的方法，采用上述詹氏丙酸杆菌工程菌为出发菌株，将32°C在厌氧瓶中静置培养48h的种子以10%的接种量转入装有发酵培养基的发酵罐中，于32°C、200rpm条件下培养150h，间歇通氮气。