[发明专利]一种菊花SSR引物的开发方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种菊花SSR引物的开发方法。

背景技术

菊花（Chrysanthemum morifolium）原产我国，栽培品种多为六倍体及其非整倍体，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用和药用价值（李鸿渐，1993），距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长期选育而成(Chen，1957;Chen，1985)。菊花花型、花色、株型等极其丰富，是盆栽、切花和园林地被应用的重要花卉种类，具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。

分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新兴技术。简单重复序列（SSR）广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。SSR标记的原理是：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，揭示其多态性。目前SSR标记被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。

随着菊花分子生物学研究的深入，分子育种在菊花中的应用将倍受关注。菊花遗传连锁图谱构建是菊花基因组研究的基础，它不仅在重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种及比较基因组学研究等方面具有重要现实意义，还能有力推进菊花基因组结构和起源进化研究。虽然SSR标记因其丰富的多态性和共显性等优点，得以广泛应用，但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。即在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。目前，大多数SSR引物的发掘是根据传统方法获得的，即构建基因组文库，然后用含有SSR的探针与之杂交，筛选阳性克隆，测序，再根据SSR两侧的DNA序列设计引物。该方法虽然测序容易，但SSR阳性克隆的得率很低。植物中已报道的阳性克隆比率约为2%～3%，成功获得引物的机率则更低。鉴于传统方法开发引物的效率很低，人们开发了富集法，即通过建立和筛选微卫星富集文库，以SSR克隆的得率。新方法虽然降低了实验成本，缩短了实验周期，且成功率高，但实验过程复杂繁琐，另外对实验室的条件也有着很高的要求。限制了此类方法在菊花遗传研究和种质改良中的应用，导致了菊花尚无SSR引物开发的报道。

EST‐SSR是SSR的重要组成部分，近年来随着测序工作的增加，数据库中EST序列的数量也随之增加，使得通过数据库搜寻法获得EST‐SSR成为可能。但是从美国国家生物技术信息中心（NCBI）保存的数据成千上万，对大量的EST序列进行格式处理、剔除载体序列和冗余序列仍是一个不小的工作量。Perl是一种自由且功能强大的编程语言。它被用作Web编程、数据库处理、XML处理以及系统管理等等。随着生物信息学的发展，Perl更多的应用到了生物数据的操作和检索中，使得对大批量数据统一处理成为可能。在此基础上进行SSR引物开发更能提高分离效率，节约时间和资金。

目前研究表明，虽然有一定数目的菊花EST序列信息在NCBI数据库中能检索到，但是利用其开发SSR费时费力，效率低下，尚未有相关SSR引物报道。因此，如果利用NCBI数据库中的EST序列信息，批量开发SSR引物的技术成熟，将会对菊花重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等方面有重要意义

发明内容

本发明的目的是针对目前菊花资源遗传丰富，但尚无SSR标记引物和反应体系情况，提供一种菊花SSR引物的开发方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种菊花SSR引物的开发方法，其特征在于包含如下步骤：

1）菊花EST序列的获得

登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，选择dbEST数据库，以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索。将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步利用；

将下载的数据使用SeqVerter^TM软件进行序列格式转化为DNAStar格式，保存以便进一步利用；