[发明专利]一种菊花SSR引物的开发方法

权利要求书

1.一种菊花SSR引物的开发方法，其特征在于包含如下步骤：

1）菊花EST序列的获得

登陆NCBI网站，选择dbEST数据库，进行菊花EST数据检索，将获取到的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理，去除序列中污染的克隆载体序列；

2）菊花SSR序列的识别

安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列和过长的序列；

从http://www.bioinformatics.org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；

从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。

3）菊花SSR引物的设计

使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/p rimer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18-22bp，Tm55-65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100-400bp；

4）菊花SSR引物有效性和通用性鉴定

提取不同栽培菊花的DNA，统一稀释为50ng/μl，-20℃保存备用。PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L^-1Mg²⁺、400μmol·L^-1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L^-1引物及10×PCR buffer。

SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55-60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性。

2.根据权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法，其特征在于步骤1）所述的菊花EST序列的获得：登陆NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，选择dbEST数据库，以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索，将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步利用；将下载的数据使用SeqVerter^TM软件进行序列格式转化为DNAStar格式，保存以便进一步利用；将格式化后的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html，去除序列中污染的克隆载体序列。

3.根据权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法，其特征在于步骤2）中所述的过短的序列指大小小于100bp的序列，所述的过长的序列指大小大于2000bp的序列。

4.利用权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法获得的菊花SSR引物对，其特征在于包括以下引物对中的任意一对:

引物1：正向引物：SEQ ID NO.1，反向引物：SEQ ID NO.2；

引物2：正向引物：SEQ ID NO.3，反向引物：SEQ ID NO.4；

引物3：正向引物：SEQ ID NO.5，反向引物：SEQ ID NO.6；

引物4：正向引物：SEQ ID NO.7，反向引物：SEQ ID NO.8；

引物5：正向引物：SEQ ID NO.9，反向引物：SEQ ID NO.10；

引物6：正向引物：SEQ ID NO.11，反向引物：SEQ ID NO.12；

引物7：正向引物：SEQ ID NO.13，反向引物：SEQ ID NO.14；

引物8：正向引物：SEQ ID NO.15，反向引物：SEQ ID NO.16；

引物9：正向引物：SEQ ID NO.17，反向引物：SEQ ID NO.18；

引物10：正向引物：SEQ ID NO.19，反向引物：SEQ ID NO.20；

引物11：正向引物：SEQ ID NO.21，反向引物：SEQ ID NO.22；

引物12：正向引物：SEQ ID NO.23，反向引物：SEQ ID NO.24；

引物13：正向引物：SEQ ID NO.25，反向引物：SEQ ID NO.26；

引物14：正向引物：SEQ ID NO.27，反向引物：SEQ ID NO.28；

引物15：正向引物：SEQ ID NO.29，反向引物：SEQ ID NO.30；

引物16：正向引物：SEQ ID NO.31，反向引物：SEQ ID NO.32；

引物17：正向引物：SEQ ID NO.33，反向引物：SEQ ID NO.34；

引物18：正向引物：SEQ ID NO.35，反向引物：SEQ ID NO.36；

引物19：正向引物：SEQ ID NO.37，反向引物：SEQ ID NO.38；

引物20：正向引物：SEQ ID NO.39，反向引物：SEQ ID NO.40。