[发明专利]一种多靶点基因检测甲型H1N1流感病毒变异株的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检验检测领域，具体涉及针对M基因和HA基因检测甲型H1N1流感病毒变异株的多靶点检测用引物、相应的试剂盒及检测方法。

背景技术

甲型H1N1流感于2009年4月由墨西哥开始，造成了全球大流行的疫情。序列进化分析显示，该病毒为一个新型甲型流感变异株，与人类季节性H1N1流感病毒和经典H1N1猪流感病毒，存在明显差异。序列分析显示它的8个基因片段具有明显特殊性。但其HA片段与北美猪流感病毒HA片段同源性最高，为95％左右；NA和M与欧亚猪源病毒片段最为相近，同源性分别为92％和97％。因此在实际的诊断与检测中，采用核酸扩增方法进行鉴别时，必须进行仔细的序列比对分析，才能确保诊断与检测的准确性。

由于PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，在甲型H1N1流感暴发后国内外很多学者研究建立了荧光RT-PCR检测方法用于检测甲型H1N1流感病毒(2009变异株)流感病毒。但是，荧光RT-PCR检测方法也存在检测中发生假阴性或假阳性的可能。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供了一种可靠的多基因靶点检测甲型H1N1流感病毒变异株的方法和试剂盒。

本发明的原理是针对M和HA基因多个基因靶点检测甲型H1N1流感病毒2009变异株，用毛细管电泳荧光探测显示序列片段大小，来直观地确定扩增的每个片段的准确性。为避免人类样品在采集，保存和运输中发生降解人类而引起假阴性结果，试剂盒中针对人类beta-2-microglobulin基因设计了引物。同时，多基因靶点层层确认阳性结果，确保了检测结果的特异性。另外。本试剂盒可以检测出非H1N1甲型流感感染，和非甲型流感感染样品，提供了进一步诊断的信息。

针对M基因和HA基因，发明人设计和建立了可靠的多基因靶点检测方法。通过仔细的序列比对分析，设计了引物针对以下基因靶点：

M基因片段–检测所有甲型流感

HA基因片段1-特异性针对甲型H1N1流感病毒(2009变异株)

HA基因片段2-检测所有H1N1的流感病毒

人类beta-2-microglobulin基因片段–检测样品中人体组织

感染甲型H1N1流感病毒(2009变异株)的病人样品，必须能扩增出以上多个片段，并在毛细管电泳中显示正确的序列片段大小。这种检测方法保证了检测结果的特异性，并且使用者能直观地通过扩增的片段大小来查看和确认检测结果。

因此，本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的针对M和HA基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的包含多组引物序列的检测试剂盒。

发明人选择甲型H1N1流感病毒(2009变异株)的M和HA基因核苷酸序列与其他A型流感病毒M和HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上进行引物设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。通过优化选择，最终获得包含如下多组引物的试剂盒：

一组针对M基因检测所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示：

1)5’-GAA TGG CTA AAG ACA AGA CC-3′(SEQ ID NO：1)

2)5’-GCT GCA GTC CTC GCT CAC T-3’(SEQ ID NO：2)

其中序列1)和2)分别为检测所有甲型流感病毒M基因的正义引物和反义引物,反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；

一组针对HA基因检测所有H1N1的流感的引物，其序列如下所示：

3)5’-GCA GAT CAA AAG AGC ACA CAA AAT-3′(SEQ ID NO：3)

4)5’-CCA AAG TTC TTT CAT TTT CCA AT-3’(SEQ ID NO：4)

其中序列3)和4)分别为检测所有H1N1流感病毒HA基因的正义引物和反义引物,反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；

一组针对HA基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的引物序列，其序列如下所示：

5)5’-CAT TCG CAA TGG AAA GAA A-3′(SEQ ID NO：5)

6)5’-TCC TCA ATC CTG TGG CCA G-3’(SEQ ID NO：6)